在研究生物体内复杂的生物反应时,可能会同时监测多种细胞或亚细胞结构的动态特性,比如分布、运动及相互作用等,而多色荧光成像技术是实现同时观察多个目标结构的重要手段。但多色荧光成像系统收集的荧光通常存在信号串扰,导致无法直接获得各种荧光团的信号强度,因此需要对串扰的信号进行光谱解混。此外,在进行多色成像时,为了获得高分辨率的图像,视场范围通常有限,而有限的视场范围难以观察到目标对象的整体,因此还需要使用图像拼接技术增大图像的视场范围。本文针对进行多色荧光成像时存在的信号串扰以及视场范围有限的问题,研究了相应的处理方法。全文包括三个部分:（1）针对多色荧光成像中的信号串扰问题,本文提出了一种基于自编码器的光谱解混算法（Autoencoder Based Spectral Unmixing Method,AE-SUM）。将自编码器与线性混合模型结合,可在不依靠荧光团光谱信息的情况下实现信号分离。该方法不需要在成像实验前测量单标样品的光谱,荧光团在不同生物环境（温度、酸碱度）下的光谱扰动也不会影响解混结果。该算法对仿真数据、离体细胞以及小鼠活体成像结果都有效地实现了荧光团分离。（2）随着样品中荧光团的种类增加,需要进行解混的荧光团种类数越来越接近系统可区分的极限数目。此外不同种荧光团之间的荧光强度差异较大,导致直接采用AE-SUM求解时准确性低。针对这些问题本文提出了一种预处理策略,先用伽马变换平衡图像中各种荧光团的强度,再使用KMeans聚类算法分割出单个细胞,最后针对单个细胞再进行AE-SUM解混,针对9通道的成像数据实现了8种荧光团的分离。（3）高分辨多色成像系统通常使用高数值孔径、大放大倍率的物镜,导致成像视场受限。为了尽可能展现生命活动的全貌,本文利用电动平移台以及图像拼接对成像视场进行扩大。在进行大视场成像时,首先对电动平移台的移动方向进行矫正以采集到呈矩形排布的图像阵列,再结合相位相关法、爬山算法以及最大生成树算法对图像阵列进行配准,从而获得无明显拼接缝与鬼影的拼接图像,成功将观察范围从84μm×84μm增加至226.0μm×224.8μm。借助本文提出的方法,结合课题组所使用的多色双光子荧光显微系统,实现了细胞以及组织水平的多色荧光成像,成像范围可达226.0μm×224.8μm。本文的研究增加了多色成像中可分辨的荧光团种类,有望为脑科学中的神经元追踪、免疫学中的肿瘤发展过程可视化提供帮助。