现代医学技术的发展，使许多肿瘤、自身免疫疾病和骨髓移植患者得到了临床上的治愈，却面临卵巢功能的严重损害；同时，越来越多的女性由于职业竞争压力的增大而一再推迟生育年龄，给优生优育带来了隐患。如何充分利用生殖资源保存女性的生育能力，是一个值得研究的重要课题。 哺乳动物卵巢组织含有数以百万计的始基卵泡，组成一个维持雌性哺乳动物—生生殖活动的卵泡库。随着个体的生长发育，始基卵泡离开卵泡静息池，启动生长，卵母细胞恢复并完成减数分裂，最后排卵；但是在雌性个体一生的生殖活动中能够成熟排卵的仅为卵泡库中极小一部分(<1％)，绝大多数卵泡在不同的发育阶段闭锁。充分利用这部分卵泡，将数百万个早期卵泡保存起来，在需要的时候进行体外培养、成熟，并生育后代，是无数科学家多年的梦想。近10多年来，随着生殖医学的发展，在人类由不成熟窦卵泡在体外培养成熟并进行体外受精的IVM技术已经取得长足进步，而有关启动早期卵泡生长发育成为窦卵泡的研究仍然没有取得突破；尽管人们已认识到在始基卵泡的发育过程中，卵泡内外不同细胞之间通过缝隙连接进行着有效沟通及对话，涉及多种细胞因子的相互作用，如KIT配体(KL，kit ligand)、抗苗勒氏管激素(AMH，anti—Mullerian hormone)等，然而启动始基卵泡生长发育的信号通路尚待阐明。 目前研究显示，启动始基卵泡生长发育的过程是不依赖垂体促性腺激素的，而卵巢局部神经的功能活动早于卵泡生长的启动。神经递质血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)在调控卵泡生长发育中的作用也引起了学者们的关注。作为G蛋白偶联受体B家族的成员之一，它的功能作用主要是由高亲合力受体VPAC1、VPAC2优先结合Gs蛋白，激活腺苷酸环化酶活动，通过环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)第二信使系统发挥生物效应。相关研究已经观察到VIP参与排卵前卵泡的若干功能活动、诱导FSH受体的形成及芳香酶活性的增强，并调节窦前卵泡的生长与窦腔形成；最近的研究发现，VIP不仅出现在生长卵泡的膜细胞层、窦前卵泡，在始基卵泡周围也有表达，提示其参与早期卵泡生长发育调控的可能性，但目前仍缺少神经肽VIP参与始基卵泡活化与生长发育机制的研究，值得我们对此进行更深入的研究。 基于当前对早期卵泡启动发育机制的研究进展，我们设想神经递质VIP可能参与了启动始基卵泡生长发育调控：本实验采用新生大鼠卵巢体外培养的方法，通过添加VIP、KL，观察VIP对始基卵泡的启动是否有作用。 材料与方法: 1.动物来源：雌性SD大鼠购自中山大学药学院实验动物中心。清洁级，出生4天，体重10-15g。 2.实验方法：在解剖显微镜下完整分离大鼠双侧卵巢，随机分配到各处理组；新鲜对照组直接固定、包埋、切片、染色，进行组织病理学检查；基础培养组以无血清基础培养液培养，VIP组、KL组分别在基础培养液中添加VIP、KL，各培养组均在37℃，5％CO2培养箱中培养14天；培养结束后卵巢经固定、包埋、切片，进行组织病理学分析、PCNA免疫组化染色，荧光定量PCR检测KLmRNA的表达，ELISA检测培养基中甾体激素水平。观察神经肽VIP对早期卵泡的启动及生长发育的影响并探讨其作用机制。 结果: 1.完整卵巢体外培养对早期卵泡体外发育的影响 新生4天大鼠卵巢在培养过程中，外观未见异常。培养结束后组织病理学观察显示，切片上仍有大量健康卵泡存活。在通过卵巢中心的最大径线切片上计数健康卵泡总数，在此基础上，于200×光镜下，进行各级卵泡分类计数，在新鲜大鼠卵巢切片上，始基卵泡(0级)在全部卵泡所占比例为66.87±7.45％，早初级卵泡(1级)占25.51±6.01％，初级卵泡(2级)占3.43±1.87％，而转化卵泡及窦前卵泡(3-4级)占4.17±1.36％；绝大部分未启动发育的始基卵泡主要分布在卵巢表面的皮质区，而较大的转化卵泡及窦前卵泡位于皮质深部，靠近卵巢中心部分的髓质区，所有新生4天新鲜大鼠卵巢切片中未观察到窦卵泡。 与新鲜大鼠卵巢不同的是，在无血清培养液中体外培养14天后的卵巢切片中，可观察到的健康卵泡总数：基础培养组141±23.25个/片，VIP组116±36.57个/片，KL组为143±40.62个/片，与新鲜未培养组(139±32.32个/片)之间未出现有统计学意义的差异。进一步进行分级卵泡分析显示，新鲜卵巢组始基卵泡比例为66.87±7.45％，与之相比较，基础培养组卵巢中始基卵泡比例明显减少至54.75±10.97％，伴随早初级卵泡比例较的明显升高(54.31±8.52％ VS36.85±11.01％)，差异有统计学意义；初级卵泡、转化卵泡及窦前卵泡的比例与新鲜卵巢相比较未显示出有统计学意义的差异。 2.VIP对始基卵泡启动生长发育的影响 在卵巢基础培养液中分别添加VIP(10-7M)、KL(50ng/ml)，以无额外添加的基础培养组为阴性对照，完全相同条件下培养14天后组织病理学观察显示：与基础培养组相比较，VIP组、KL组切片上卵巢表面皮质区的始基卵泡明显减少，同时该区域的生长卵泡增加；经分级卵泡计数，KL组平均每张切片上始基卵泡比例为34.02±5.44％，VIP组始基卵泡比例下降到36.82±4.69％，伴随着生长卵泡比例的上升(KL组65.97±5.44％、VIP组63.17±4.69％)，各组间静息/生长卵泡比例经统计分析显示：与基础培养组相比较，VIP、KL组始基卵泡比例降低、生长卵泡比例升高，差异有统计学意义；进一步的生长卵泡分类分析显示，早初级卵泡比例的升高有统计学意义，p<0.01。与KL组不同的是，在VIP组还观察到接近皮质表面转化卵泡生成，3-4级(转化卵泡及窦前卵泡)比例升高，5.25±3.06％ VS3.48±1.27％，但差异未显示出统计学意义，p=0.151。 3.PCNA免疫组织化学染色评价卵泡生长 未经培养的新鲜卵巢切片中，始基卵泡基本不着色，但观察发现有个别始基卵泡的卵母细胞着色；从早初级卵泡开始，生长卵泡中的颗粒细胞呈现PCNA阳性着色，在各级卵泡中，初级卵泡才开始出现明显的卵母细胞着色。阴性对照组未观察到阳性着色。与新鲜对照组相似，基础培养组、VIP组培养14天后进行免疫组化染色后显示早初级卵泡已出现PCNA着色，主要在卵母细胞，虽然在扁平梭形的前颗粒尚未见着色，但卵母细胞周围的柱状颗粒细胞开始显示阳性，其他各级生长卵泡的卵母细胞、颗粒细胞均显示阳性。与健康正常的各级生长卵泡的强PCNA着色不同，在闭锁卵泡，卵母细胞的PCNA着色减弱，同时，颗粒细胞的着色开始减少、缺失非常显著。在新鲜未培养组，只有34.17±5.02％的卵泡中至少有一个颗粒细胞显示PCNA阳性；经14天体外培养后，基础培养组、VIP组中分别有30.78±8.07％、48.53±5.45％的卵泡中出现着色颗粒细胞。统计分析显示，新鲜组与基础培养组之间PCNA阳性卵泡比例差异无统计学意义，p=0.484；而VIP组PCNA阳性卵泡比例高于新鲜组及基础培养组，差异有统计学意义，p<0.001。 4.VIP对KL mRNA表达的影响 新生4天大鼠18只，按配对设计，用实时定量RT—PCR分析不同培养条件下卵巢KL mRNA表达量，在VIP培养组较对照组升高，1.73+1.042 VS0.76±0.46，经配对样本t检验，p=0.039，差异有统计学意义。 5.VIP对雌激素、雄烯二酮分泌水平的影响 组织培养过程中，每隔1天更换一次培养液，收集并低温保存，培养结束后，将VIP组、基础培养组收集的培养液每二孔合并成一个测量单位，应用ELISA检测雄烯二酮、雌二醇水平。培养液中可检测到雌二醇、雄烯二酮的分泌，两组培养液中雄烯二酮水平在不同培养时间点上未显示有统计学意义的差异，且变化趋势相似；而VIP组在培养第8、10、12天雌二醇水平有升高趋势，但差异未显示出统计学意义。 结论: 1.通过新生大鼠完整卵巢体外培养可以观察早期卵泡的体外生长发育情况，体外启动发育的早期卵泡维持着功能活动及继续生长的潜力； 2.VIP在体外培养中可以促进新生大鼠始基卵泡启动发育，上调KL表达可能是其调控早期卵泡生长的作用机制之一。