【背景】1971年Folkman教授首先提出了血管生成是实体肿瘤生长和转移的必要条件之一后,肿瘤血管靶向性治疗逐渐成为目前抗肿瘤综合治疗领域研究的热点。但是,已发现的具有血管抑制作用的分子因其肿瘤血管靶向性不强,临床应用的效果并不令人满意。有研究表明,不同组织的血管具有异质性,因此找到这类特异性分子用于临床,对肿瘤血管靶向性治疗的研究有着重要的意义。前期我们通过建立人胃低分化腺癌的小鼠肾包膜下异种移植瘤模型,利用噬菌体随机环七肽库体内筛选得到了能特异性结合于胃癌血管的环形肽GX1(CGNSNPKSC),免疫组织化学染色证实GX1在体外能够特异性结合于人胃癌组织血管。同位素标记肽SPECT成像结果显示,短肽能够体内靶向到荷人胃癌移植瘤裸鼠的肿瘤组织;将重组质粒编码的融合蛋白GX1-rmhTNF经尾静脉注入裸鼠体内,发现该融合蛋白不仅能靶向结合于肿瘤组织,抑制肿瘤的生长,而且可以进一步降低rmhTNF的全身毒副作用;MTT实验和鸡胚尿囊膜实验结果显示,GX1不仅能够抑制co-HUVECs体外增殖能力及微管形成能力,而且具有体内抑制血管生成作用。以上研究表明GX1在体内外均具有靶向于胃癌血管并抑制血管生成的作用。然而,GX1实现其靶向性及生物学活性的机制尚不清楚。在此基础上,我们实验室利用免疫沉淀-质谱的方法筛选获得了3个与GX1结合的受体候选蛋白。对获得的候选蛋白进行进一步鉴定以找到其靶向分子对充分阐明GX1的生物学活性和作用机制至关重要。【目的】对前期筛得的GX1(CGNSNPKSC)受体的候选蛋白进行进一步鉴定,同时改进实验方法进一步筛选GX1可能的受体。【方法】(1)原代分离培养人脐静脉内皮细胞,采用形态学及免疫细胞化学染色方法对其进行鉴定。(2)将人脐静脉内皮细胞与SGC7901细胞进行共培养体外模拟胃癌微环境诱导异质性分子的表达。(3)采用免疫组织化学和免疫细胞化学染色的方法,检测前期筛得的候选GX1受体分子二酰基甘油激酶ι(DGKι)在组织及细胞系中的表达。(4)提取人脐静脉内皮细胞及共培养人脐静脉内皮细胞的蛋白,采用western blot方法鉴定GX1结合受体的理化性质。(5)采用基于生物素-亲和素系统的免疫沉淀法,利用生物素标记的GX1分离与GX1特异性结合的蛋白条带。(6)利用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI/TOF/TOF)及生物信息学方法,对GX1特异识别的目的条带进行测序鉴定及分析。【结果】(1)倒置相差显微镜下观察原代分离的人脐静脉内皮细胞24小时呈岛状生长,48小时细胞呈短梭形单层向外生长,72小时融合成片呈铺路石样外观;免疫细胞化学染色显示,原代培养细胞表达内皮细胞特征性分子CD31和Factor VIII相关抗原。(2)免疫组织化学染色结果显示, GX1和DGKι抗体在人胃腺癌及相应的癌旁组织上的着色分布有一定差异。(3)免疫细胞化学染色结果显示,GX1和DGKι抗体在人脐静脉内皮细胞、SGC7901、MKN45、MKN28、GES细胞系上的着色分布及强度有差异。(4)利用免疫沉淀和western blot的方法,鉴定并获得与GX1特异性结合的蛋白条带,其分子量在10-15KDa之间。(5)通过基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI/TOF/TOF)及生物信息学分析对该目的条带进行测序鉴定及分析,获得了一个有意义的候选蛋白核苷二磷酸激酶A(NDPKA)。【结论】(1)成功分离、培养原代人脐静脉内皮细胞,并证实其具有内皮细胞的生物学特性。(2)初步证实前期筛得的蛋白DGKι与GX1结合受体在组织、细胞系上的表达、分布存在一定差异,其作为GX1结合受体的候选分子尚存致疑。(3)通过改进实验方法重新筛选GX1结合受体,获得一个有意义的候选分子蛋白核苷二磷酸激酶A(NDPKA),为进一步鉴定GX1的受体、研究其功能奠定了基础。