钩苞大丁草(Gerbera delavayi Franch.)又名“火草”、“火石花”,其叶背毡毛纤维是我国西南少数民族人民编织火草服饰的原料。火草线的获得是从鲜叶叶被直接剥离并同时捻线,这项特殊的纺织技艺已有500多年的历史,被列为云南省和四川省的非物质文化遗产。目前,还未见关于钩苞大丁草的纤维特性方面的报道。因此,为了深入研究和开发这一新型天然植物纤维,对纤维的形态与结构、化学成份、物理特性等方面展开研究十分必要。除手工纺织外,钩苞大丁草还具有较高的药用和观赏价值。前期调研发现,钩苞大丁草尚未实现人工种植,其野生资源已遭到严重破坏,亟待保护性开发。遗传多样性研究是钩苞大丁草保护性开发的重要依据,而分子标记是揭示遗传多样性最理想的方法。为此,本项目将建立由云南省石林彝族自治县居群(SL)、云南省新平彝族傣族自治县居群(XP)、云南省武定县居群(WD)、云南省富源县居群(FY)、云南省丽江市居群(LJ)、云南省洱源县居群(EY)、云南省开远市居群(KY)、云南省普洱市居群(PE)、四川省德昌县居群(SDC)共9个钩苞大丁草居群构成的资源圃。利用基于转录组数据开发的genic-SSR荧光标记,阐明钩苞大丁草的遗传多样性及遗传结构,以期为钩苞大丁草的保护性开发策略提供科学依据。1)钩苞大丁草的叶背纤维特性研究。钩苞大丁草叶背纤维的化学成分与棉相似,其蜡质含量高出棉的四倍。钩苞大丁草纤维表现出极低的长度(3-8 mm)、细度(0.3-0.5dtex)、弱韧性(0.5-0.6 c N/dtex)、密度(0.9 g/cm3)和结晶度(14.6%),但其断裂伸长率、回潮率与棉类似。此外,钩苞大丁草纤维拥有光滑的表面、柔软的质地,还有不浸润水的特性。在纤维的收集方法方面,钩苞大丁草叶片在40°C的热水中浸泡1分钟,其捻线长度显著高于钩苞大丁草叶片在4°C冷藏10分钟的处理以及对照。热水浴处理后,与对照相比,纤维的蜡质含量下降了20%,且热稳定性更好。纤维的尺寸较小阻碍了钩苞大丁草纤维的标准纺线以及现代纺织机器的使用。但这一独特的纤维素纤维可在不经过任何化学处理的前提下,单独或与其它纤维混合用于手工纺织。今后,更加高效的纤维收集方法、单纤维长、产量高的钩苞大丁草种质筛选及其独特的纺织技术都是有潜力的研究方向。2)钩苞大丁草的Genic-SSR分子标记开发。从钩苞大丁草叶片的转录组测序数据中选择长度大于1000bp的Unigene,使用MISA软件查找出Genic-SSR位点5179个,使用primer3软件设计出Genic-SSR引物3464对。通过位点和引物初选,获得350对Genic-SSR引物。从每个居群随机选个1个样本,加接头引物后进行一次扩增,经琼脂糖凝胶电泳后,筛选出条带单一且浓度较好的引物61对。再加荧光引物二次扩增,进行毛细管电泳,上3730测序仪测序,最终筛选出21对特异性高、多态性好的Genic-SSR引物用于全面扩增。3)钩苞大丁草的遗传多样性研究。获得基因多态数据后,再进行21对引物的中性检验,选用19对引物进行遗传多样性及遗传结构分析。在9个野生居群的204个钩苞大丁草个体中,共检测出154个等位基因位点,平均每个位点等位基因数目为8。有效等位基因(Ne)总数为44.7307,平均每个位点有效等位基因数目为2.2365。观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的均值分别为0.3049和0.4649。多态信息含量(PIC)的平均值为0.4317,19个位点中,有7个高度多态位点(PIC>0.5)和7个中度多态位点(0.25<PIC<0.5)。可见,本研究筛选的19个SSR位点具有较好的多态性,可用于钩苞大丁草的群体遗传研究。9个野生群体的平均遗传多样性偏低(Na=3.8596,Ne=2.0548,I=0.7894,Ho=0.3043,He=0.4152)。除XP外,其余8个野生群体内均有私有等位基因(Np),平均每个群体含有5.1111个私有等位基因,表明各群体内存在一定的遗传变异。此外,9个野生群体的近交系数(Fis)平均值为0.2617,表现为纯合子过剩。此外,9个野生群体内部均极显著的偏离哈迪温伯格平衡,说明各居群内近期的交配不遵循随机交配模式,等位基因的分布不是很均匀。综上,9个野生钩苞大丁草的群体遗传一致性较高,遗传多样性不是很丰富。4)钩苞大丁草的遗传结构研究。在STRUCTURE HARVESTER计算中,得到的最适delta K值为5,表明9个野生群体中5个基因库的存在。当K=5时,PE的野生个体的基因组成主要来源于基因库1,表明PE与其它群体间存在较为明显的遗传分化。而其余的8个野生群体均为其他4个基因库的混合,在各基因库中所占比例较为均匀。可见,钩苞大丁草9个野生居群的遗传结构比较单一。9个野生群体的遗传距离都维持在较低水平(均值0.1169)。基于Nei的遗传距离的UPGMA聚类分析表明:9个野生群体被大体划分为了3个组,位于滇南地区的PE被单独划为第一组,滇西北地区的LJ和EY被划为第二组,滇南东南地区的KY、滇中地区的FY、SL、WD、XP和金沙江以北的SDC划入第三组。基于个体的UPGMA图显示出组间和群体间的个体存在着较多的交叉混合,表明群体内基因交流频繁、群体间分化不明显。PCo A结果显示,PE(第一组)与其它2个组分离明显,第二组和第三组出现大量的交叉、混合,表明PE与其它2组间的差异较大,第二组和第三组同质性高、遗传关系较近。这一结果与STRUCTURE和UPGMA结论相似。Mantel检测结果显示,9个野生钩苞大丁草群体间的遗传距离和地理距离有极显著的正相关关系(r=0.573),表明地理距离或地理隔离(IBD)对钩苞大丁草群体间的遗传距离具有显著的影响。9个野生群体的分子方差分析(AMOVA)表明:大部分的遗传变异(89.03%)存在于群体内部,仅有10.97%的遗传变异来自于群体间,与STRUCTURE和UPGMA分析结果相似。FST为0.1097,表明野生群体间存在着中度的遗传分化。基于UPGMA聚类的3组分子方差分析显示:大部分的遗传变异存在于各组内(89.41%),而3组间也仅存在中度的遗传分化(FST=0.1059)。本项目的开展,建成的钩苞大丁草资源圃将为其核心种质库的构建奠定基础,为后期的优异纤维种质筛选、栽培及育种研究提供材料;钩苞大丁草的遗传多样性研究将为其野生资源的保护性开发提供科学依据;转录组数据可为后期的纤维形成机理、重要基因的深入研究提供参考;Genic-SSR标记可为钩苞大丁草重要经济性状的关联分析和基因标定奠定基础;钩苞大丁草纤维评价有助于人们对最短的天然纺织纤维——钩苞大丁草叶背毡毛纤维的深入认识,进而促进其深度开发,对非物质文化遗产——火草纺织技艺的继承和发扬具有重大意义。