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(S)-度洛西汀作为一种5-羟色胺(5-HT)受体及去甲肾上腺素(NE)受体双受体抑制剂对重度抑郁症、糖尿病周围神经痛、女性压力型尿失禁、纤维肌痛综合征、经期前心境恶劣障碍均有显著治疗效果。(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙胺((S)-DMAA)作为(S)-度洛西汀合成过程中重要手性中间体,相较于传统的化学催化法和外消旋体拆分方法,生物催化制备(S)-DMAA拥有高光学纯度、环境污染小、反应条件温和等优势,但野生型菌体中羰基还原酶表达量较低导致催化效率低、辅酶不能循环利用使得成本偏高、底物抑制导致转化率较低等问题限制了其工业化的应用。为解决生物催化法中存在问题,我们通过重组工程菌,基于底物偶联和酶偶联法建立了生物合成(S)-DMAA的高效、低成本、绿色新方法。通过优化表达条件,实现重组酶可溶性高表达,通过底物偶联和酶偶联法同时实现羰基还原和辅酶再生,从而降低生产成本。进一步优化生物转化反应条件以提升催化效率及产物转化率。具体结果包括:1.表达质粒构建及酶表达。选择来自Lactobacillus kefir的醇脱氢酶(Lk-ADH)和Rhodosporidium toruloides的醇脱氢酶(Rt-ADH)作为羰基还原酶,来自Bacillus megaterium的葡糖糖脱氢酶(GDH)作为辅酶再生酶。将编码酶的全长基因片段全合成,再与pET28α载体连接,形成重组质粒pET28α-lk-adh、pET28α-rt-adh和pET28α-gdh。优化重组工程菌诱导酶最适表达条件,Lk-ADH:15℃,0.4 mM IPTG诱导48 h,酶活性:524 U/L。Rt-ADH:30℃,0.4 mM IPTG诱导24 h,酶活性:813U/L。蛋白浓度分别为1.41 mg/mL和1.85 mg/mL。SDS-PAGE分析表明两种羰基还原酶均能可溶性高表达。2.生物催化不对称合成(S)-DMAA。分别采用异丙醇底物偶联和GDH酶偶联法进行催化合成(S)-DMAA,优化生物转化温度、底物浓度、辅酶浓度和辅底物浓度。最适反应条件为Lk-ADH:50℃、pH 7、0 mM辅酶、16.6%(V/V)异丙醇、底物/催化剂质量比为1.6/1。转化时间4 h,转化率99.4%,ee值>99.5%,产率85.3%。Rt-ADH:30℃、pH 7、0 mM辅酶、134 mM葡萄糖、底物/催化剂质量比为2.4/1。转化时间4 h,转化率99.6%,ee值>99.5%,产率85.8%。FT-IR、1HNMR、13CNMR和LC-MS分析产物结构与目标化合物结构一致,构型为S型。