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背景当肝脏遭遇慢性严重损伤时,位于门静脉区终末胆管和Hering管内的成体肝祖细胞(hepatic progenitor cells,HPC)活化、增殖、分化为成熟的肝细胞和胆管细胞,并迁移入肝小叶,以此来修复受损的肝脏。研究表明,严重病毒性肝炎时,肝祖细胞可以分化为成熟的肝细胞;而在原发性胆汁性肝硬化等疾病时,肝祖细胞可以分化为胆管细胞。动物实验也表明,肝祖细胞可以分化为HNF-4α阳性的肝细胞和CK19阳性的胆管细胞。肝祖细胞活化与肝脏损伤严重程度密切相关,其活化、增殖、分化、迁移受多种因素的影响。肝祖细胞迁移是其参与肝再生过程中一重要环节,该过程受多种生物活性物质和信号通路的调节。现已发现,HGF、IL-6、CTGF等细胞因子和炎症因子能调控肝祖细胞的生物学功能。肝细胞生长因子(HGF)/及其受体c-Met能调控肝祖细胞迁移。c-Met缺陷小鼠在肝损伤时肝祖细胞数量减少,迁移能力受损,并且分化为肝细胞的能力下降。Yeoh等研究发现IL-6在小鼠体内可以促进肝祖细胞增殖和迁移,ERK-1/2的激活可以抑制这一反应。Pi等发现在2-乙酰基氨基芴/部分肝切除术(2-AAF/PHx)大鼠,结缔组织生长因子(CTGF)可以促进肝祖细胞的增殖和迁移。转化生长因子β(TGF-β)是慢性肝脏疾病重要的调节因子,其在肝脏炎症反应、肝脏再生、肝纤维化和肝癌中均发挥重要作用。严重肝损伤后随着TGF-β的增加,TGF-β对成熟肝细胞的生长表现为抑制作用和促凋亡作用,然而肝祖细胞仍然能够介导肝再生。Robert等发现TGF-β1与EGF共同作用于肝祖细胞,可引起细胞形态变化。Yang等将经TGF-β1预处理后的肝祖细胞移植给大鼠,发现大鼠肝脏细胞外基质增加,肝纤维化加重。基于以上研究,我们认为在肝再生过程中,TGF-β能够调节肝祖细胞的生物学行为。本研究拟探讨TGF-β对小鼠肝祖细胞基因表达谱和迁移能力的影响及其潜在的分子机制。目的探讨转化生长因子β(TGF-β)在体外对肝祖细胞迁移能力的影响及其作用机制。方法两步灌注法分离雄性野生型C57BL/6J小鼠原代肝祖细胞,用不同浓度TGF-β刺激,相差显微镜下观察细胞形态,划痕试验和Transwell试验评估TGF-β对肝祖细胞迁移能力的影响,表达谱测序分析TGF-β对肝祖细胞基因表达的影响,并对差异基因进行功能富集分析和信号通路分析。采用TGF-β信号通路磷酸化抗体芯片PTG176检测TGF-β对肝祖细胞信号通路的调控作用,检测PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路蛋白水平及各信号分子在肝祖细胞中的定位。采用信号通路抑制剂LY294002、MK2206、Rapamycin和LY2584702来进一步证实TGF-β促进肝祖细胞迁移的作用机制。结果1、TGF-β促使肝祖细胞由卵圆形变为长梭型,划痕试验和Transwell试验发现TGF-β可以促进肝祖细胞迁移。2、表达谱测序结果表明TGF-β调控肝祖细胞基因表达,其差异表达基因参与调控细胞形态和细胞迁移,KEGG信号通路分析发现差异表达基因参与ECM-receptor interaction、PI3K-AKT 等信号通路。3、信号通路磷酸化抗体芯片检测发现,TGF-β上调myc、Abl1、AKT1、Shc、PKC zata、Smad1的磷酸化水平。其中AKT1与我们前面的表达谱测序信号通路分析中的PI3K-AKT信号通路相吻合。Western blot检测发现,肝祖细胞经TGF-β处理后,PI3K 110、pAKT1、mTOR及p70S6K的水平均明显升高,且呈剂量依赖性。同时免疫荧光结果显示p70S6K,AKT1和PI3K与F-actin共定位。4、信号通路抑制剂 LY294002、MK2206、Rapamycin 和 LY2584702 能抑制TGF-β所介导的肝祖细胞形态改变和迁移。结论TGF-β能够通过PI3K/AKT/mTOR/p70S6K通路促进肝祖细胞迁移,p70S6K,AKT1和PI3K信号分子参与调控肝脏祖细胞形态和迁移。