【摘 要】
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L-苹果酸是一种重要的四碳化合物,在食品、医药、化工等行业有着广泛的应用。目前苹果酸的合成主要有化学合成法、酶法和发酵法。微生物发酵法合成苹果酸,具有立体选择性高、原料成本低、副产物少等优点。C.glutamicum是经典的食品性安全菌,在厌氧条件下,丙酮酸在丙酮酸羧化酶（PYC）的作用下生成OAA,再还原为L-苹果酸,该途径的糖酸转化率为200%。本研究通过强化r TCA途径和苹果酸跨膜转运等,
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L-苹果酸是一种重要的四碳化合物,在食品、医药、化工等行业有着广泛的应用。目前苹果酸的合成主要有化学合成法、酶法和发酵法。微生物发酵法合成苹果酸,具有立体选择性高、原料成本低、副产物少等优点。C.glutamicum是经典的食品性安全菌,在厌氧条件下,丙酮酸在丙酮酸羧化酶（PYC）的作用下生成OAA,再还原为L-苹果酸,该途径的糖酸转化率为200%。本研究通过强化r TCA途径和苹果酸跨膜转运等,获得提高L-苹果酸产量的工程菌株,具体内容如下:（1）增强r TCA途径的苹果酸脱氢酶（MDH）:利用敲除系统p K19mobsac B进行反向筛选,在mdh基因上游敲入强启动子gapA（Pgap）,通过上调MDH酶活性,促进OAA转化生成L-苹果酸,重组菌株命名为C10。发酵培养结果表明:C10菌株苹果酸产量为23.2 g/L,较对照菌株提高了34.5%。（2）上调内源苹果酸转运蛋白活性:在C.glutamicum内源四碳二羧酸转运蛋白Sdas基因上游敲入强启动子gapA,通过上调内源上Sdas活性,促进苹果酸的跨膜转运,重组菌株命名为C11。发酵培养结果表明:C11菌株苹果酸产量为25 g/L,较对照菌株提高了7.2%。（3）不同来源的苹果酸转运蛋白基因的过表达:在C.glutamicum中异源过表达来自E.coli MG1655的苹果酸转运蛋白Dcu C,以及过表达来自C.glutamicum内源的苹果酸转运蛋白Sdas,构建的重组菌株分别命名为C10-1和C10-2。结果表明:重组菌株C10-1和C10-2的苹果酸产量分别为40.8 g/L和31.6 g/L,较对照菌株分别提高了75.86%和36.2%。（4）提高细胞生长生物量:通过敲除谷氨酸棒杆菌的三磷酸腺苷脱磷酸酶基因amn,通过增加胞内ATP的含量,有利于菌株的生长而获得更高的生物量,从而提高L-苹果酸产量,构建的菌株命名为C12,与对菌株相比,C12苹果酸产量提高了9.6%。（5）不同代谢改造的重组鼓棒菌发酵产酸对比分析:重组鼓棒菌改造的途径包括:敲除丙酮酸旁路代谢途径、增强羧化途径、TCA循环相关途径改造、苹果酸转运通路。其中丙酮酸旁路代谢途径改造包括敲除pta-ack、ldh A、pqo、mal E基因,重组菌株C04苹果酸产量为11.8 g/L;羧化途径改造包括敲入强启动子Psod,上调PPC和PYC,以及对PPC进行点突变,消除产物反馈抑制,重组菌株C08苹果酸产量为16.8 g/L;TCA循环相关途径改造包括敲除mqo、amn基因,敲入强启动子Pgap,上调MDH、Sdas,重组菌株C12苹果酸产量为27.4 g/L;苹果酸转运通路改造包括敲入强启动子Pgap,上调Sdas,过表达Sdas和Dcu C,重组菌株C10-1苹果酸产量为40.8 g/L。本研究通过同源重组双交换对C.glutamicum进行了系列遗传改造,野生型鼓棒菌几乎不积累苹果酸,改造后的重组菌株C10-1苹果酸产量达40.8 g/L,同时杂酸含量大幅度降低,这为获得高产L-苹果酸工程菌株提供了参考依据。
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