论文部分内容阅读
免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是动物血液中最重要的免疫因子,主要应用于提高人体的免疫力,增强对各种疾病的抵抗力。其中的IgG是最重要的抗体,IgG具有中和毒素和病毒、凝集作用、激活补体、亲细胞等功能,在体液免疫中发挥着“主力免疫”的作用。本研究以新鲜的鹅血为原料通过饱和硫酸铵法对鹅血清中的IgG进行分离提取,得到IgG粗提物。然后经过sephadexG-50凝胶层析和DEAE-52阴离子交换层析等纯化方法,将制备的IgG进一步纯化,得到纯度95%以上的IgG。最后对IgG的稳定性进行研究。以新鲜的鹅血为原料,利用盐析法对鹅血清中的IgG进行分离提取,得到IgG的粗提物。根据单因素的实验结果,通过四因素五水平二次旋转正交组合实验设计,采用响应面分析法对提取温度、静止时间、血清-PBS比例和缓冲溶液pH等因素进行了优化,鹅血清中IgG的最佳提取工艺条件为:提取温度35℃,静止时间58min,血清-PBS比例2:1,缓冲溶液pH7.2,此时的IgG提取量达到0.681mg/mL。通过方差分析和验证实验,数学模型可靠并且拟和较好。通过对IgG粗品分离纯化工艺的研究,利用正交实验确定层析纯化IgG的最佳条件,实验得到的最佳层析工艺参数为:流速为1.0mL/min,洗脱液pH为7.6,进样浓度为2.5mg/mL。采用sephadexG-50对样品脱盐,并用DEAE-52对脱盐后的样品进行分离纯化,最后用SDS-PAGE电泳检测样品纯度,测得样品纯度为96%,且特异性强。对鹅血清IgG的稳定性进行了详细的研究,结果显示:加热对鹅血清IgG稳定性影响较大,75℃加热7min,85℃加热2min,其变性率均达到90%以上,在同一加热条件下,随着加热时间的延长,变性率增加;鹅血清IgG在pH5.0-10.0范围内十分稳定,在pH低于5.0时,随着pH降低,变性率迅速上升。过酸、过碱均会影响IgG活性;正交试验表明:胃蛋白酶对IgG变性率的影响的主次顺序是:pH>作用时间>酶液浓度;最优工艺条件为pH4.0,胃蛋白酶加入量0.5mg/mL,作用时间1h;胰蛋白酶对IgG活性的影响相对较小,且变性率与酶用量和作用时间呈正相关。在溶液中加入保护剂对IgG的活性有明显的保护作用,麦芽糖、山梨醇、甘氨酸对IgG活性保留率的保护效果大小依次为:山梨醇>甘氨酸>麦芽糖;通过三因素二次旋转组合实验筛选出了较为理想的复合热保护剂添加量:麦芽糖6%、山梨醇11%和甘氨酸0.6%。此时,IgG的活性保留率为53.2%。