论文部分内容阅读
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分:构建Tet-on调控稳定表达HGF、FGF4的人类MSCs细胞株 目的:通过慢病毒转染UE7T-13细胞，构建Tet-on基因开关调控稳定表达HGF、FGF4的人类骨髓间充质干细胞株。 方法:全基因合成HGF和FGF4序列，通过酶切、重组分别构建包含目的基因HGF、FGF4的两个慢病毒载体plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TO-FGF4，包装并计算其滴度。以UE7T-13细胞最适MOI值稀释慢病毒Lenti3.3/TR，并转染UE7T-13细胞，加入加入抗生素Zeocin筛选，获得带有Tet-on基因调控开关的UE7T-13-TR细胞株。采用已构建好的慢病毒plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TO-FGF4分别转染UE7T-13-TR细胞并经过抗生素Blasticidin筛选，构建Tet-on调控稳定表达HGF的UE7T-13-TR-HGF细胞株和Tet-on调控稳定表达FGF4的UE7T-13-TR-FGF4细胞株。通过QPCR、Western Blot及Elisa在基因、蛋白及蛋白分泌水平检测目的基因HGF、FGF4的表达情况。 结果:成功构建UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞株。经QPCR检测，当Tet存在时，HGF基因在UE7T-13-TR-HGF中的表达为无Tet时的78倍;FGF4基因则超过2万倍，且1μg/ml的Tet为较佳浓度。Western Blot及Elisa结果在蛋白表达水平及蛋白分泌水平验证了以上结果，证明已合成的HGF及FGF4能成功分泌到细胞外。 结论:通过慢病毒转染UE7T-13细胞，我们成功构建出Tet可调控稳定表达HGF、FGF4细胞株（UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞株），为进一步的研究奠定了良好的实验基础。 第二部分:可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞肝向自身诱导分化能力的验证 目的:验证由第一部分构建成功UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞的肝向自身诱导分化能力。 方法:通过细胞表面标记验证UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞的MSCs细胞特性;通过MTT实验鉴定以上两种细胞的增殖能力;肝向诱导分化实验分为4组:A组:UE7T-13-TR-HGF/UE7T-13-TR-FGF4细胞外源性加入诱导因子35 ng/mlHGF及35 ng/ml FGF-4; B组:UE7T-13-TR-HGF加入1μg/ml Tet;C组:UE7T-13-TR-FGF4加入1μg/ml Tet; D组: UE7T-13-TR-HGF细胞与UE7T-13-TR-FGF4细胞共培养（按共培养比例不同，分为三个亚组:2∶1;1∶1;1∶2）加入1μg/ml Tet。通过细胞形态学、RT-PCR、免疫荧光、流式及肝细胞相关功能检测鉴定诱导分化后的细胞。 结果:约90％的细胞为CD90+CD44+CD45-，表明转染后细胞仍保留间充质干细胞特有的表面标记，且纯度较高。MTT实验证明UE7T-13-TR-HGF细胞及UE7T-13-TR-FGF4细胞保留了UE7T-13细胞原有的增殖能力;但在Tet存在条件下其增殖能力受到抑制。诱导分化实验证实UE7T-13-TR-HGF细胞及UE7T-13-TR-FGF4细胞保留了MSCs细胞的肝向诱导分化能力，且能在1μg/ml Tet的调控下自身表达、分泌高浓度HGF、FGF4，并诱导自身分化为肝样细胞。 结论:由第一步构建的两种细胞能在Tet存在条件下，高效诱导自身分化为有功能的肝样细胞，且UE7T-13-TR-HGF细胞与UE7T-13-TR-FGF4细胞以1∶2比例混合具有更高的自身诱导分化能力，为最佳搭配方案，并有望应用于肝脏组织工程及再生医学。 第三部分:可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞大规模增殖及自身诱导分化能力验证 目的:验证由第一部分构建成功的可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞的大规模增殖及其自身诱导分化能力。 方法:通过微载体Cytodex3培养方式将UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞以1∶2比例进行悬浮培养培养，显微镜下动态观察细胞生长情况并计数，验证细胞在微载体上增殖情况并得到最佳增殖时间。采用第一步按最佳增殖时间大规模增殖，第二步加入Tet进行自身诱导分化的方法进行细胞肝向诱导分化，光镜、电镜观察细胞形态变化，免疫荧光及功能鉴定分化后的细胞。 结果:细胞密度于培养第7天达到高峰，为1.76±0.12×109/L。干细胞于诱导分化第8天可见细胞形态改变，且经免疫荧光及肝细胞相关功能鉴定为肝样细胞。 结论:通过Cytodex3微载体培养，我们发现UE7T-13-TR-HGF细胞与UE7T-13-TR-FGF4细胞能增殖到肝脏组织工程及再生医学所需的细胞量，且成功分化为有肝细胞功能的肝样细胞，有望应用于肝脏组织工程及再生医学。由此，我们确立了第一步增殖、第二步分化，由干细胞获得大规模有功能肝样细胞的有效方案。