HERG是一种电压依赖性钾通道蛋白，正常只在人心肌和脑组织中表达，而在其他组织中几乎不表达。文献报道它与细胞的增殖、分化以及肿瘤的形成有关。在多种肿瘤细胞和组织中表达，而在其相应的正常组织中却不表达。在某些肿瘤中HERG的表达程度还与恶性程度成正相关。应用HERG通道的特异性阻断剂可以抑制肿瘤细胞的增殖，侵袭能力。因此，HERG通道蛋白可以作为一个肿瘤治疗潜在的靶点。对HERG电流有阻断作用的临床药物中抗菌药物占有很大的比例。司帕沙星就是一例。本研究主要探讨HERG钾通道在癌细胞中的表达水平及作用机制，并以司帕沙星作为特异性阻断HERG的抗菌药物阻断剂，研究其对癌细胞的抗肿瘤作用，及作为肿瘤治疗分子靶向调节剂的作用。比较研究了4个结肠癌细胞系，经Western blot分析表明，HERG蛋白在4系结肠癌细胞中均有较高程度的表达，其中，HT-29和HCT116细胞的表达量最高。作为阴性对照的HEK293细胞不表达HERG蛋白。进一步采用RT-PCR法在mRNA水平检测结肠癌细胞中berg基因的表达情况。berg基因在HEK293细胞中没有表达，而在4系结肠癌细胞中均有表达，与Western blot结果一致。为研究HERG通道蛋白在肿瘤细胞中的功能，我们通过基因转染的方法来使HEK293细胞表达目的蛋白，观察细胞生物学行为的变化。提取pcDNA3.1／herg质粒，转染入HEK293细胞中，48h后，可以检测到HERG蛋白的表达。以此细胞为模型，采用生长曲线法和克隆形成法检测HERG通道蛋白对HEK293细胞增殖的影响。结果显示，转染后的HEK293／HERG细胞的生长速度较野生型HEK293及HEK293／MOCK细胞明显加快，克隆形成率显著增加，且不受血清浓度的影响。表明HERG通道蛋白能促进细胞的增殖。文献报道抗菌药物红霉素，克拉霉素，司帕沙星，左氧氟沙星和氟康唑都对HERG通道有阻断作用。为了观察这些非肿瘤化疗药物是否具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，经MTT法检测和IC₅₀比较，结果表明，司帕沙星、红霉素、克拉霉素对结肠癌细胞有不同程度的抑制作用；而左氧氟沙星和氟康唑对结肠癌细胞的IC₅₀均在300μM以上，没有明显的细胞毒作用。司帕沙星对HCT116细胞的作用较强，其IC₅₀为74.83μM，对HT-29细胞的作用较弱，其IC₅₀为137.57μM。而红霉素则对HT-29细胞的作用较强，其IC₅₀为98.56μM，对HCT-116细胞的作用较弱，IC₅₀为243.52μM。因此，在后续的实验中用司帕沙星和红霉素对结肠癌细胞的增殖抑制作用及机理进行研究。2BS细胞和NIH／3T3细胞是不表达HERG的二倍体细胞，以它们作为模型，来评价司帕沙星和红霉素对正常细胞的细胞增殖抑制作用。司帕沙星对2BS细胞和NIH／3T3细胞的IC₅₀分别为214.05μM和232.82μM，明显高于司帕沙星对结肠癌细胞的IC₅₀值。红霉素对2BS和NIH／3T3细胞的IC₅₀也明显高于对结肠癌细胞的IC₅₀值。说明不表达HERG通道蛋白的二倍体细胞对于红霉素和司帕沙星较不敏感。为了进一步比较司帕沙星对于高表达HERG的结肠癌细胞和不表达HERG的二倍体细胞两者之间增殖抑制的差异，观察细胞受大剂量司帕沙星作用的生存天数。结肠癌细胞受300μM司帕沙星作用只能存活1-2天。而二倍体细胞能耐受高达800μM的司帕沙星，仍然可以存活1-2天，在300μM司帕沙星的作用下可以存活6-7天。为了探讨靶向HERG的抗菌药物对肿瘤细胞增殖抑制的机理，以司帕沙星为研究对象，从影响细胞周期和调亡两方面来阐明。司帕沙星可以剂量依赖性的抑制4系结肠癌细胞的增殖，且不受血清浓度的影响。为了更直接地观察司帕沙星对细胞的生长抑制作用是否是通过靶向抑制HERG通道起作用，我们通过MTT法检测司帕沙星对转染HERG的HEK293细胞毒作用。结果显示司帕沙星对转染pcDNA3.1／herg的HEK293细胞抑制作用显著高于未转染的HEK293细胞以及转染pcDNA3.1／mock的HEK293细胞，其IC₅₀为57.65μM。为研究司帕沙星对肿瘤细胞增殖抑制的分子机制，采用TUNEL标记法和Annexin V-FITC／PI双染结合流式细胞仪检测司帕沙星对人结肠癌HCT116细胞凋亡诱导作用。TUNEL标记法结果显示，处理后的细胞发生明显的DNA断裂。Annexin V-FITC／PI双染法结果显示随着司帕沙星剂量的增加，诱导HCT116细胞的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例均明显增加，并且诱导早期凋亡细胞的比例增加更为显著。为了更直接的证明司帕沙星对细胞的凋亡诱导作用是通过靶向HERG通道蛋白起作用，采用Annexin V-HTC／PI双染法检测司帕沙星对pcDNA3.1／herg转染的HEK293细胞的凋亡诱导作用。司帕沙星能够诱导转染pcDNA3.1／herg的HEK293细胞出现早期凋亡的细胞，对野生型HEK293细胞和转染pcDNA3.1／mock的HEK293细胞则没有明显的诱导凋亡作用。这充分证明了司帕沙星通过阻断HERG通道蛋白而诱导细胞出现凋亡。进一步检测凋亡相关蛋白的变化。细胞经大剂量的司帕沙星作用后，凋亡相关蛋白Bcl-2，procaspase-3和NF-κB表达水平均明显下降。进一步研究司帕沙星对肿瘤细胞细胞周期的影响，流式细胞仪结果显示，与对照组相比，司帕沙星可以使HCT116细胞的G₁期细胞比例减少，使细胞S期和G₂／M期增加。200μM的司帕沙星可以使细胞的S期和G₂／M期分别与对照组相比增加到了29.3％和22.1％。说明司帕沙星可以使细胞发生S期和G₂／M期的阻滞。为了进一步观察司帕沙星是否对肿瘤细胞的运动迁移能力有影响，采用划痕实验观察不同浓度司帕沙星对HCT116单层细胞汇合能力的影响。与对照组细胞相比，司帕沙星抑制细胞向划痕处移动，且随着剂量的加大，抑制细胞向划痕中心移动的能力也越大。采用明胶酶谱法检测司帕沙星对HCT116细胞分泌MMP-2和MMP-9的影响，结果显示，经50μM、100μM、200μM和300μM司帕沙星处理48h后，HCT116细胞Ⅳ型胶原酶的分泌受到显著抑制，且呈剂量依赖性。采用重组基底膜侵袭实验把不同浓度的司帕沙星加入到铺有HCT116细胞的Transwell小室，48h后HCT116细胞穿越重组基底膜的能力明显下降。司帕沙星能剂量依赖性的抑制HCT116细胞的侵袭能力。为了观察司帕沙星对HERG通道蛋白表达的影响，把不同浓度司帕沙星分别作用于HCT116和HT-29细胞48h，司帕沙星对HERG蛋白表达水平基本没有影响。EGFR／PI3K／Akt信号通路是与细胞的增殖、凋亡和分化有关的重要细胞信号通路。300μM的司帕沙星可以降低EGFR和AKT蛋白的表达，而EGFR和AKT蛋白磷酸化水平受司帕沙星抑制明显，这说明EGFR／Akt信号通路参与了司帕沙星对结肠癌细胞的增殖抑制过程。为观察司帕沙星的分子靶向调节作用，选用对结肠癌细胞有增殖抑制作用的抗肿瘤药物，把司帕沙星与之联合。结果发现司帕沙星与HCPT，CDDP，DOX和MMC没有体现出协同作用，与5-FU，VCR和Taxol有协同作用。单独10μMSPFX对HCT116以及30μM SPFX对HT-29细胞的抑制率分别为89.3％和84.2％，把10μM SPFX与不同浓度的5-FU，VCR，Taxol联合作用于HCT116细胞，有明显的协同作用。把30μM SPFX与不同浓度的5-FU，VCR，Taxol联用作用于HT-29细胞也体现出协同作用。为进一步确认SPFX和5-FU联合的对细胞周期的影响，采用流式细胞术检测SPFX联合5-FU处理后对HCT116细胞周期的影响。结果显示，5-FU单独作用组细胞阻滞作用不明显，当5-FU与SPFX联合后，S期和G₂期显著高于对照组以及5-FU单独作用组，表明SPFX可以增加5-FU对细胞的S期和G₂期阻滞作用。为了观察司帕沙星与其他药物联合对肿瘤细胞凋亡的影响，采用PI单染法和Annexin V-FITC／PI双染结合流式细胞仪检测司帕沙星与5-FU联合处理后的HCT116细胞凋亡情况。PI单染法检测凋亡率，单独作用的5-FU没有诱导出现凋亡细胞，5-FU分别与100μM、200μM SPFX联合后，细胞的凋亡率较单独应用SPFX明显增加。Annexin V-FITC／PI双染法结果也体现出相同的趋势，5-FU分别与100μM、200μM SPFX联用后，早期凋亡细胞的比例分别增加到28.37％和33.12％。司帕沙星与5-FU联合可以增强5-FU诱导细胞凋亡的作用。红霉素与司帕沙星对结肠癌细胞均有较强的增殖抑制作用，为了观察这两者针对同一靶向的药物联用是否有协同增效作用，把红霉素与司帕沙星按等摩尔比例混合配制成记做SPFX-ERM作用于各种结肠癌细胞48h，检测细胞对药物的敏感性变化。四系结肠癌细胞在SPFX与ERM的联合作用下，比同等剂量受单用SPFX或ERM作用时，IC₅₀值均有不同程度的降低，提示SPFX与ERM联合作用于结肠癌细胞比单用药物显示出更为明显的增殖抑制作用。为了进一步探讨SPFX与ERM联合作用对结肠癌细胞的增殖抑制作用，采用先加SPFX 24h后再加入ERM，先加ERM 24h后再加入SPFX，以及同时加入SPFX-ERM这3种加药方式比较对HCT116和HT-29细胞的作用效果。结果表明，药物敏感性与给药方式有关。把SPFX-ERM与5-FU联合作用于HCT116细胞和HT-29细胞72 h，SPFX-ERM与5-FU联合对HCT116细胞和HT-29细胞有协同作用。先加入SPFX-ERM再加VCR作用的联合给药方式对HCT116细胞和HT-29细胞的协同作用均比较显著，而采用先加入VCR再加入SPFX-ERM的联合给药方式对HCT116细胞和HT-29细胞没有显示协同作用。利用小鼠皮下移植性肝癌22模型检测SPFX和SPFX-ERM的体内抗肿瘤活性。小鼠皮下接种24h后腹腔注射15mg／kg 5-FU，每日1次，司帕沙星设200mg／kg，400mg／kg和800mg／kg 3个剂量，口服给药，每日1次，连续10天，第11天计算抑瘤率，结果显示单独应用司帕沙星没有明显抑瘤效果，司帕沙星与5-FU联合抑瘤率为41.08％。进一步观察了SPFX-ERM组合药的体内抑瘤效果。SPFX-ERM组合药设200mg／kg，400mg／kg和800mg／kg三个剂量，口服给药，每日2次，连续10天。5-FU腹腔注射30mg／kg，隔日给药，共5次。结果显示单用SPFX-ERM的抑制率分别为37.5％，64.7％和88.7％，SPFX-ERM与5-FU联用抑制率为88.7％，CDI为0.85。SPFX-ERM单用以及SPFX-ERM与5-FU联用均有明显的抑瘤作用。本研究表明，HERG通道蛋白与细胞的增殖能力相关。司帕沙星可以通过阻断HERG通道蛋白的功能抑制结肠癌细胞的增殖，诱导凋亡和引起细胞周期阻滞。司帕沙星与红霉素联合，司帕沙星与其它化疗药联合在体内和体外均有协同增效作用。司帕沙星可以作为分子靶向调节剂与化疗药联用治疗结肠癌。