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局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是常见的肾小球疾病,占我国成人原发性肾小球肾炎的7.0%,临床上表现为大量蛋白尿,早期研究表明足细胞损伤与大量蛋白尿的产生密切相关,足细胞受损、脱落构成肾小球硬化发生发展的关键环节。细胞免疫功能异常在FSGS发病机制中起着重要作用,FSGS患者T细胞释放的细胞因子可导致足细胞损伤,其中Th2细胞因子,如IL-13和IL-4被认为可能是主要致病因子,在肾病综合征复发患者,CD4+和CD8+ T细胞的IL-13和IL-4 mRNA表达升高,同时胞浆IL-13和IL-4蛋白水平表达也升高。原位杂交技术检测发现,FSGS患者肾组织中IL-13和IL-4 mRNA表达增加,且肾小管间质区IL-13和IL-4 mRNA表达量与肾功能变化及24h尿蛋白排泄呈正相关。有研究表明,足细胞上表达IL-13受体和IL-4受体,IL-13和IL-4与相应受体结合,可直接损伤足细胞骨架结构,破坏细胞间连接蛋白,造成滤过膜通透性的破坏。FSGS患者足细胞损伤的同时,常伴随肾小管上皮细胞损伤,这点在组织形态和功能上都有明确的体现,并成为FSGS诊断和鉴别诊断的一个重要特点。既往的观点认为大量蛋白尿致肾小管上皮细胞损伤、肾小球节段硬化致出球小动脉狭窄和相应肾单位缺血性损伤、肾小球毛细血管襻和包曼囊壁粘连使尿液反渗入肾间质触发间质炎症反应是FSGS肾小管间质损伤的原因,但这些机制可能造成的组织损伤及其转归不足以完全解释临床上观察到的现象。部分表现为超大量蛋白尿(>10g/24h)的FSGS患者,尿蛋白谱分析往往是大分子和小分子蛋白混合存在,这种情况只有在近曲肾小管吸收功能严重受损时才会发生;一些对治疗敏感的患者,在大量蛋白尿缓解的同时,反映肾小管损伤的指标也迅速地得到改善,这类患者肾活检病理常常伴有近端肾小管的急性损伤,于是我们推测,是否可能有一些导致足细胞病变的因素同时直接攻击了肾小管上皮细胞,使其功能和结构发生改变,进而触发后续的间质病变以及间质纤维化。既然已证实IL-13和IL-4可通过足细胞上IL-13受体和IL-4受体导致足细胞损伤,那么,我们推测,在FSGS患者肾小管上皮细胞损伤中可能也存在同样的分子发病机制。为探讨IL-13和IL-4对近端肾小管上皮细胞的损伤作用,本研究借助人近端肾小管上皮细胞系(HK2),研究人近端肾小管上皮细胞IL-13受体和IL-4受体的表达及IL-13和IL-4对肾小管上皮细胞的影响,并探讨其作用机制。第一部分:肾小管上皮细胞IL-13受体和IL-4受体的检测目的:检测人近端肾小管上皮细胞IL-13受体和IL-4受体的表达。方法:1.细胞人近端肾小管上皮细胞系(HK2)购自ATCC(CRL-2910TM)。2.用RT-PCR和免疫荧光方法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测HK2细胞上IL-13受体和IL-4受体的表达。结果:1.RT-PCR结果显示正常培养的HK2细胞有IL-13 I型受体和IL-4 II型受体的组成亚链―IL-13Rα1和IL-4Rα的mRNA表达。2.免疫荧光结果显示正常培养的HK2细胞有IL-13 I型受体和IL-4 II型受体的组成亚链―IL-13Rα1和IL-4Rα蛋白质表达,呈颗粒状均匀分布在HK2胞浆中。结论:人近端肾小管上皮细胞表达IL-13 I型受体和IL-4 II型受体。第二部分:IL-13受体和IL-4受体在肾小管损伤中的作用目的:通过观察IL-13和IL-4对近端肾小管上皮细胞的损伤标志物RANTES以及信号传导通路JAK-STAT6的影响情况,分析IL-13和IL-4对肾小管上皮细胞的损伤作用,并探讨其机制。方法:1.IL-13和IL-4对HK2细胞的影响作用用免疫荧光的方法观察分别用不同浓度(10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml)的IL-13和IL-4干预HK2细胞12-48小时后HK2损伤标志物RANTES的变化情况。2. IL-13和IL-4对HK2细胞的损伤机制1)Western blot方法检测不同时间-浓度的IL-13和IL-4分别干预HK2细胞后,JAK-STAT6信号通路的活化情况。2) Western blot方法检测JAK-STAT6信号通路特异性抑制剂――来氟米特对IL-13和IL-4作用HK2细胞的JAK-STAT6信号通路激活的影响。3)用免疫荧光的方法观察来氟米特对IL-13和IL-4作用HK2细胞后RANTES变化的影响。结果:1.IL-13和IL-4呈时间-剂量依赖性影响近端肾小管上皮细胞RANTES的表达。50ng/ml IL-13、100ng/ml IL-4作用HK2细胞48h后的损伤作用最为明显。正常培养的HK2细胞RANTES呈阴性,50ng/ml IL-13和100ng/ml IL-4干预48小时后,阳性细胞显著增多。2. IL-13处理组的JAK-STAT6磷酸化水平在50ng/ml作用10min时开始升高(磷酸化水平为对照组的222.4%±81.9%),在50ng/ml 20min时达高峰,(磷酸化水平为对照组的307.8%±40.7%);IL-4处理组的JAK-STAT6磷酸化水平亦在50ng/ml作用10min时开始升高(磷酸化水平为对照组的294.0%±59.7%),并于100ng/ml 20min时达高峰,(磷酸化水平为对照组的1618.0%±229.9%)。3.来氟米特干预+IL-13处理组和来氟米特预干预+IL-4处理组与阴性对照相比,JAK-STAT6磷酸化水平均无明显变化,磷酸化水平与阴性对照组相比分别为:43.6%±0.4% vs 41.2%±2.4%,P>0.05,20.6%±0.8% vs 14.9%±6.7%,P>0.05,无统计学差异;而较阳性对照STAT6磷酸化水平明显降低,相比分别为:43.6%±0.4% vs 89.3%±8.3%,P<0.01,20.6%±1.4% vs 44.8%±7.5%,P<0.05,均有统计学差异。4.来氟米特干预+IL-13处理组较IL-13处理组、来氟米特干预+IL-4处理组较IL-4处理组,HK2细胞RANTES的表达均显著减弱,与阴性对照无明显差别。结论:1. IL-13和IL-4可通过人近端肾小管上皮细胞上的相应受体造成细胞损伤,表现为RANTES表达增加。2. IL-13和IL-4的上述作用与细胞内JAK-STAT6信号通路活化密切相关。