基因芯片是专门用于核酸检测的生物芯片,也是目前用途最为广泛的微阵列芯片。无论是单色荧光或双色荧光基因芯片,其本质都是利用碱基互补的核酸分子杂交。常见的基因芯片是一种反向杂交技术,将cDNA文库中大量的基因序列固定于载体上,用于同时检测比较生物样品中多个基因的表达状况。另一种基于芯片的正向杂交技术则是将生物样本中特定片段固定于载体上,实现在一张芯片上针对同一SNP位点的检测个体数目高通量。近年来基因芯片技术被越来越多的生物学家用于研究癌症的发生发展过程,无论是比较癌症组织与正常组织之间基因表达的差异,或是对疾病相关SNP位点的研究,基因芯片技术正扮演着一个越来越重要的角色。在基于基因芯片研究鼻咽癌的发生发展过程的课题中,我们首先利用了双色荧光cDNA芯片,用鼻咽癌炎症组织作为参照,对20例鼻咽癌病例样本进行了表达谱分析,结合生物信息学和生物统计学方法,我们筛选出了一批对于鼻咽癌发生发展具有研究价值的基因,如核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, RPS6KC1)等,一些基因在大部分病例中都发生了显著变化的基因,有些基因在鼻咽癌中还是首次报道如STE20-类似蛋白激酶(STE20-like kinase, JIK)等。同时,我们还利用生物信息软件寻找可能参与鼻咽癌发生发展的重要的生物学通路,我们鉴别出了一些重要的信号通路,如Wnt受体信号调控通路(regulation of Wnt receptor signaling pathway)等。Wnt信号通路在胚胎发育与肿瘤发生、发展等关键的生理、病理过程中起着重要作用。已经有报道在多种癌症中发现Wnt的异常,其受体信号通路很可能在鼻咽癌的发生发展中起到了重要的作用。同时,我们根据病人的实际放疗后的疗效信息,将鼻咽癌样本分为放疗敏感性组和放疗不敏感性组,筛选出一批在鼻咽癌敏感性病例与非敏感病例中差异表达的基因,我们从中选取了包括PPP1CC等在内的重要的12个基因构建了鼻咽癌敏感性分型判别式。这为避免对放疗不敏感的病人使用放疗的治疗手段有重要的意义。我们进一步分析了鼻咽癌敏感性的分子机理,找到一些有意义的可能决定鼻咽癌敏感性分型的途径,如：细胞内诱导凋亡信号(induction of apoptosis by intracellular signals)等。这些途径中基因的表达水平不一样可能是鼻咽癌分型的重要原因。我们还结合样本的临床资料情况,对其中一例病人在放疗前后的表达谱进行了研究,找到了一些在放疗前后变化差异显著的基因帮助我们理解放疗这一过程在基因表达水平对于病人的影响。我们从系统和整体的角度出发,对鼻咽癌的发生发展机制和敏感性分型机理进行了探讨。我们找出的许多差异表达基因反映了鼻咽癌细胞中细胞周期、增殖、生长、凋亡和信号传导等方面的异常。其中一部分基因的功能还尚不清楚,需要深入研究。在研究鼻咽癌基因表达水平的同时,我们发现有文献报道了选择合适的内参基因作为归一化内参基因的必要性,一些其他癌症中已经有这样的研究,但在鼻咽癌中尚未有统一的标准。于是我们利用芯片数据构建模型计算在鼻咽癌中表达稳定的基因群,并用荧光定量PCR的方法结合生物分析软件geNorm计算出了最适合鼻咽癌使用的内参基因HPRT1和YARS,这为以后在基因表达水平的研究提供了可靠的归一化内参基因。此外,我们知道癌症的发生往往伴随着染色体的片段缺失,在染色体水平,我们利用杂合性缺失实验寻找了4个可能发生缺失的位点,分别是3号染色体短臂、9号染色体长臂、11号染色体长臂和13号染色体长臂上D3S1300、D9S318、D11S4946和D13S796。这4个位点的研究和报道比较少,我们分析了这4个位点后,发现了确实存在不同频率的杂合性缺失。这几个区域中不乏一些重要的抑癌基因,如I型多发性内分泌肿瘤(multiple endocrine neoplasia type 1, MEN-1)等。这提示我们这些区域的缺失也许在鼻咽癌的发生发展中起到了重要作用。本文除了研究了鼻咽癌发生发展的机理,还对金丝桃素光动力疗法治疗鼻咽癌的机理进行了研究。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)已经应用于一些其他癌症的治疗中,本文研究了用金丝桃素作为光动力疗法的敏感剂,对于鼻咽癌细胞的杀伤能力和毒性作用。我们选用鼻咽癌细胞株CNE-2做为实验对象,通过MTT法检测了细胞的生长情况,同时利用流式细胞仪检测了细胞周期和细胞凋亡的变化。我们发现鼻咽癌细胞株在金丝桃素做为光敏感剂的诱导下,生长状态发生了明显的变化,不仅G1期细胞比率明显降低,S期和G2期的比率明显升高,细胞还发生了凋亡现象。为了在基因表达谱水平检测细胞内部发生变化的分子机理,我们又利用illumina微珠芯片检测了鼻咽癌细胞株在光诱导不同时间点下表达谱水平发生的变化。我们找到了许多有意义的差异表达基因,并发现潜在的重要的生物信号途径可能参与了这一生物学应答过程,如：损伤应答(response to wounding)、外界刺激应答(response to external stimulus)、缺氧应答(response to hypoxia)等等。这些差异基因参与的信号途径反应了鼻咽癌细胞在受到金素桃素光诱导下产生的细胞损伤和防御功能在短时间内发生了巨大的改变。在本文中,我们应用了2种不同的基因芯片(cDNA芯片,微珠芯片)研究了鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞在基因表达水平发生的变化。为了进一步理解和探讨基因芯片的动力学原理,我设计并构建了双色荧光正向杂交平台。这一平台是将样本上待检测的基因片段通过PCR、纯化后的点在芯片上,用已知序列的探针去杂交,这样在同一张芯片上实现检测样本数目的高通量。这一技术对于某些重要的疾病相关SNP位点在大样本量的检测中有独特的优势,国内关于这个技术的动力学研究报导还不多。在实验中,我们系统的比较了样本PCR产物的点样浓度,长度和检测荧光标记探针的长度对Cy3和Cy5信号值及ratio值(Cy5/Cy3)的影响。我们对参数进行了优化,制作的双色荧光正向杂交芯片可以取得重复性好,精确性高以及可靠行好的SNP分型结果。