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实验背景： 血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖是动脉粥样硬化形成、高血压、冠心病、经皮冠状动脉腔内血管成形术后再狭窄的病理基础，所以探讨抑制VSMC增殖的药物成为人们研究的热点。 细胞增殖是取决于增殖细胞在细胞外信号的影响下细胞周期的有序进展，细胞周期主要依次由G1，S，G2和M四个期组成，且存在两个限制点，即G1-S限制点和G2-M限制点，这其中G1-S限制点更为重要，是细胞中很多调节因子及胞外刺激作用的位点。细胞周期的G1-S限制点主要被一系列周期蛋白和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（称之为细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）复合物）调控。p21和p27蛋白属细胞周期一蛋白依赖性激酶抑制剂家族，主要通过抑制oS限制点中的各种周期蛋白及CDK使细胞周期酚于GofGI期。近年研究表明p27在正常动脉中持续表达，动脉损伤后下调，但在动脉损伤修复时明显上调，和VSMC的增值呈负相关。pZI在正常动脉中不表达，同样在动脉损伤修复时明显上调，也和VSMC的增值呈负相关。p27基因缺失小鼠出现了多种器官过度增生，但不会产生肿瘤，说明了 pZI，p27均与 VSMC的增值呈负相关。 NF＊ B是细胞内具有转录激活作用的转录因于，是由 P50和 P65两个亚基组成的异二聚体，但在非活化细胞中，NF4B则位于细胞质内，与一个 36 kD的阻遏蛋白 IK B结合形成而处于非活化状态的。IK B可以抑制NF八B的核定位信号，从而使其以非活性复合物形式被锚定于细胞质内。I。B家族包括I。Ba，I。Bp，I。B。等，其中以I。Ba最为重要，研究也最深人。当细胞受到丝裂原等外来信号刺激时，I。Ba被磷酸化而失活，使NF4B能够进人细胞核，并通过与。B增强子及启动子相互作用而促进基因表达。NF八B在调节与炎症、细胞分化和细胞增殖密切相关的基因表达中起重要的作用。 近来研究认为 NF4 B位于 COX2的上游，能转录调节环加氧酶毛 （Cyclooxygenase－2，COX－2）基因的表达。COX－2是前列腺素合成的限速酶，在静止细胞中缺乏，但它的表达在血清、细胞因子、致丝裂原和其他致细胞增殖因素的作用下能明显增加，且COX2一旦被诱导，就会大量表达，并大量调节释放前列腺产物。Wilson等研究认为在TNF川和血管紧张素11诱导的 VSMC增殖中，COX1和 VSMC增殖明显正相关。最近研究认为动脉粥样硬化病灶血管中 C似z表达明显增高，而正常血管中检测不到。以上表明C皿毛的表达和VSMC增殖、动脉粥样硬化明显呈正相关。 二一 小白菊内酯（p尬nolide，又名 Sesquiterpene lactone）是艾叶菊属黑叶母菊的提取物，主要成分是倍半菇烯内酯，西方国家较为常用，主要用于治疗皮肤感染、风湿病和偏头痛，但近年来发现小白菊内酯能调控细胞内多种信号途径，如抑制巨噬细胞中脂多糖诱导的C皿，肿瘤坏死因子。（TNF－a）和白细胞介素＊的表达，能抑制人单核细胞中iNOS的表达，能抑制 Hela细胞中 NF－。B的活性，抑制肿瘤细胞的生长，同时能减轻心肌缺血再灌注损伤等，但小白菊内酯在VSMC中的于预研究目前国内外非常罕见，为了确切评价小白菊内酯对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及相关的信号转导机制，我们进行了一些研究。实验目的： 探讨小白菊内酯对大鼠血管平滑肌细胞的细胞周期和增殖的抑制作用以及对相关的蛋白 IK B Q，COX毛，pZI，p27表达的影响。实验方法 血管平滑肌细胞的体外培养、鉴定及细胞毒性实验：组织贴块法培养VSMC，无菌条件下分离SD大鼠的胸主动脉，剪碎后加人含10％胎牛血清吓etal bovine serum，FBS)的DMEM培养液，37C，5％CO。培养箱中静置培养。用光镜和兔疫化学方法进行鉴定。实验用4～6代细胞，细胞毒性实验采用台盼蓝染色。本研究所用小白菊内酯浓度无毒性，细胞存活率达95．0％以上。 细胞周期测定：细胞经无FBS的 DMEM培养 24 h后加人 10％FBS的DMEM及终浓度为 0，10，20，30 Pmol·L”‘小白菊内酯，作用 24h后将细胞制成单细胞悬液，收集后 70％冷乙醇固定，经离。O，0．5 d·L‘碘化丙唆 3一染色和300目筛网过滤处理后，用流式细胞仪（Coulter，Ben’ITlan公司）进行细胞周期测定，重复3次。 ［功TdR参人量测定：选用生长良好的第4至第6代VSMC，用培养液调整细胞密度为每毫升 IX10’个细胞，接种于24IL培养板，每孔 IInL。培养24h后更撅FBS的DMEM培养24h，然后加人10％FBS及0，10，20，30 pmLL‘浓度小白菊内酯，孵育 16 h后每孔内加人 37MBq·L’［’H］TdR，孵育 8 h，加人冷磷酸盐缓冲液（PhosPhat buffered saline，PBS）终止反应，并用10％三氯醋酸固定，lmol．L“‘氢氧化钠裂解，加人闪烁液在液闪计数仪上测定rH」TdR参人量kPm值X重复 3次。 Western印迹分析：细胞经上述处理后，无FBS的DMEM培养24 h，然