论文部分内容阅读
目的:
通过Gateway技术结合酶切连接的方法,将ECFP基因、CYFP基因与人SUMO基因连接起来形成ECFP-SUMO-EYFP融合基因,并将此基因在大肠杆菌BL21中表达,为进一步的荧光共振能量转移研究打下实验基础。
方法:
1.通过PCR技术将ECFP基因扩增出来,并通过两步法PCR反应和BP反应将ECFP基因片段克隆到到质粒pDeliver02,构建入门克隆ECFP Dev02,并经过提取质粒、经酶切鉴定,并测序确定。
2.通过PCR技术将EYFP基因扩增出来,并通过两步法PCR反应和BP反应将EYFP基因片段克隆到到质粒pDeliver01,构建入门克隆EYFP Dev01,并经过提取质粒、经酶切鉴定,并测序确定。再通过酶切、连接和RJ反应,将EYFP基因克隆到表达载体pReceiver-B01.1中,构建表达载体EYFP B01.1。
3.构建融合基因:PCR扩增SUMO1,SUMO2,SUMO3基因,通过酶切、连接,与EYFP B01.1构建融合的SUMO1-EYFP B01.1,SUMO2-EYFP B01.1,SUMO3-EYFP B01.1表达载体;PCR扩增ECFP基因,纯化该基因,通过酶切、连接,分别与SUMO1-EYFP B01.1,SUMO2-EYFP B01.1,SUMO3-EYFPB01.1构建ECFP-SUMO1-EYFP B01.1, ECFP-SUMO2-EYFP B01.1,ECFP-SUMO3-EYFP B01.1融合基因表达载体。
4.融合基因ECFP-SUMO1-EYFP,ECFP-SUMO2-EYFP,ECFP-SUMO3-EYFP分别在大肠杆菌BL21中表达并纯化,通过用SDS-PAGE鉴定融合基因,并通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,最终得到纯化后的融合蛋白,并以酶切实验初步分析了SENP相对于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特异性。
结果:
1.成功的构建入门克隆ECFP Dev02和EYFP Dev01,成功构建表达载体EYFPB01.1。
2.成功的构建融合基因ECFP-SUMOs-EYFP,并同时构建SUMOs三种亚型的融合基因。
3.ECFP-SUMO-EYFP蛋白在大肠杆菌BL21获得可溶性表达,SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)与预期相符,ULP、SENPs对底物ECFP-SUMOs-EYFP的酶切特异性检测表明ECFP-SUMOs-EYFP可被有效酶切用于荧光共振能量转移底物。
结论:
利用pReceiver-B01.1表达载体表达ECFP-SUMO-EYFP蛋白,为进一步的荧光共振能量转移研究打下了实验基础。