背景结直肠癌是全球第三大恶性肿瘤,在肿瘤死因中排第四位。美国癌症协会(American Cancer Society)公布了2014年结直肠癌相关数据,预测在2014年美国将有136930新发病例,并估计50310人将死于该病,是全美第三大肿瘤。由于早期筛查包括大便隐血试验、乙状结肠镜检查及电子结肠镜检查的普及与治疗水平的提高,在发达国家结直肠癌的发病率及死亡率已有所下降。而在中国,由于人们生活水平的提高及生活环境、饮食结构改变及早期筛查意识较差等原因,结直肠癌发病率呈上升趋势,严重地威胁人们的生命健康。据报道,20%结直肠癌在确诊时便为转移性结直肠癌,而另外的病例中的50%将在疾病进展中出现转移瘤,总生存期约为20个月。目前研究表明结直肠癌的形成及进展与许多分子及其下游信号通路相关,其中与RAS及RAS信号通路关系最为密切。通常体内RAS蛋白活性受两类重要的作用相反分子的调控而处于平衡状态：即RASGEFs (Guanine nucleotide exchange factors,鸟嘌呤核苷酸交换因子)和RASGAPs (GTPase activating proteins, GTP酶活化蛋白)。RASGEFs分子可促使非活化状态的RAS-GDP转化为活化状态的RAS-GTP,开放RAS信号通路,而RASGAPs则可通过增加RAS蛋白内源性的GTP酶活性,促进活性形式的RAS-GTP水解形成RAS-GDP非活性形式,关闭RAS信号通路,起着负性调控作用。当RAS突变后(多见于肿瘤状态),RAS蛋白不能与RASGAPs结合,RASGAPs作用丧失。然而,RASGEFs仍然能发挥作用,导致RAS蛋白始终以RAS-GTP活化状态,非正常地持续活化RAS信号通路,主要为RAS-PI3K-Akt信号通路和RAS-RAF-MEK-ERK信号通路,促进细胞增殖和抑制细胞凋亡并最终向恶性型转化、促进肿瘤转移。RAS-GEFs超家族成员包括RASGRF1/2, SOS1/2, RASGRP1/2/3/4 (CalDAG-GEFs), C3G, Epac 1/2 (cAMP-GEFs), RalGDS家族成员,RalGPS, PDZ-GEFs, BCAR3,MR-GEF, Smg GDS和磷酯酶Cε等。多个研究表明RASGEFs可能作为促癌因子在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用,且对于野生型及突变型KRAS基因都有调控作用。RASGRF1为RASGEFs超家族成员之一,Tarnowski, M.等的研究发现RASGRF1在横纹肌肉瘤、皮肤鳞状细胞癌等肿瘤中表达升高,下调RASGRF1可抑制这些肿瘤细胞增殖、转移。我们的前期研究筛查了结直肠癌组织和结肠癌细胞中的RASGEFs mRNA表达谱,结果发现RASGRF1, SOS1, RASGRP1, RASGRP2四个分子在结直肠癌组织和结肠癌细胞中表达明显增高。同时我们也已发现干扰RASGRF1表达可以减少RAS-GTP形成,即干扰RAS蛋白活化。目前关于RASGRF1在结直肠癌组织表达情况及其临床意义,及调节RASGRF1对结肠癌细胞的生物学行为影响尚未见报道,有待进一步研究。目的通过免疫组织化学二步法检测结直肠癌病人癌组织和癌旁正常组织、结直肠腺瘤中RASGRF1的表达,进一步分析结直肠癌组织RASGRF1表达水平与结直肠癌临床病理参数相关性,探讨其在结直肠癌中的可能作用及临床意义。通过RNAi技术下调KRAS突变型结肠癌细胞株HCT116的RASGRF1表达水平,检测对细胞增殖、凋亡、细胞周期及细胞迁移能力影响,初步探讨RASGRF1对结肠癌细胞株生物学行为作用,为结直肠癌早期诊断、预后及靶向治疗提供新的分子靶标。方法1.收集广东省人民医院2008年至2011年间经病理组织学证实诊断,具有完整病例资料的35例非连续结直肠癌组织、35例癌旁正常结肠组织(距离癌组织大于5cm以外的癌旁组织)、35例结直肠腺瘤组织石蜡包埋标本。标本按照标准流程制成厚度约4gm石蜡切片。所有结直肠癌患者手术前均未接受过放疗、化学治疗及免疫治疗、生物治疗。结直肠癌的分期参照美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)结直肠癌TNM分期系统(第七版)。2.用EnVision二步法进行免疫组织化学染色,检测RASGRF1在结直肠癌组织、结肠腺瘤组织、癌旁正常组织石蜡切片中表达部位及强度。主要步骤如下：切片在65℃烤箱放置3小时,二甲苯、酒精浸泡脱蜡及水化。新鲜配制抗原修复液Tris-EDTA1500-3000ml,高温高压修复3分钟。冷水冲淋高压锅,以尽快降压,自然冷却20分钟至室温。双蒸水泡洗切片。免疫组化油性笔圈化组织,加入3% H2O2 100ul,室温下避光孵育10分钟,PBS洗切片。10%羊血清室温封闭10分钟,小心甩去封闭液。加入50u1一抗RASGRF1抗体稀释液,湿盒4℃孵育过夜。次日室温下复温30分钟。PBS冲洗。滴加50-100u1二抗A液(Envision+/HRP)于组织上,室温下孵育40分钟。PBS冲洗。滴加50-100ulDAB工作液,光镜下控制显色,蒸馏水冲洗终止显色。苏木素复染及自来水中返蓝。梯度酒精、二甲苯浸泡脱水。中性树脂封片胶封片,烤片至干。3.转染KRAS突变型结肠癌细胞HCT116:转染时细胞融合度达70%左右。设置实验组、阴性对照组及空白对照组。按照每孔200μL Opti-MEM Reduced serum Medium及每孔5μLMAX的量分别取适量,进行混合,此为溶液A。按照说明书推荐的最适RASGRF1 siRNA转染浓度计算出每孔需加入的RASGRF1 siRNA体积。按照每孔200μL Opti-MEM Reduced serum Medium及每孔适宜量RASGRF1 siRNA,进行混合,此为溶液B。将溶液A与溶液B进行混合,轻轻混匀,在室温下孵育20分钟。与此同时,弃去原6孔板中培养基,用无血清培养基轻柔冲洗两遍后,每孔加入2mLOpti-MEM Reduced serum Medium。 20分钟后,将混合液均匀分入每孔中,轻轻前后晃动6孔板使其混合混匀,将6孔板置于37℃、5%CO2温箱中培养。qPCR验证转染效率。4.CCK-8检测细胞增殖：取生长良好无污染且处于对数期的细胞,取适量胰酶消化,制备细胞悬液,进行细胞计数,调整细胞浓度至104个每孔,接种至96孔板。培养24小时,按照上述方法转染RASGRF1 siRNA及阴性对照,培养48小时；每孔加入10μL CCK-8,用酶标仪在450nm波长下分别测定加入CCK-8后24小时、48小时、72小时的OD值。以时间为横轴,增殖率为纵轴绘制生长曲线。5.细胞凋亡实验：取生长良好无污染且处于对数期的细胞,细胞转染后48小时后,将细胞培养板各组的培养基分别转移到15ml的锥形管中并置于冰上。用2 ml冰PBS溶液轻轻润洗培养板内细胞,去除PBS溶液。加入0.5ml 0.25%不含EDTA胰酶,收集细胞。将细胞轻轻重悬于上述的培养基中使得其密度大约为1×106细胞/ml。将0.5 ml细胞悬液从细胞培养板中(5×105个细胞)转移到一个干净的离心管内。加入1.25μl Annexin V-FITC,室温(18-24℃)避光反应15分钟。室温1000xg离心5分钟,去除上清。将细胞用0.5 ml预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬。加入10 μl Propidium Iodide。将样本放置在冰上避光保存。立即用流式细胞仪检测分析。6.取生长良好无污染且处于对数期的细胞,细胞转染后48小时后每样收集1×106细胞细胞固定：离心收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗细胞两次,加入预冷70%乙醇,于4℃固定过夜。细胞染色：离心收集细胞,以1mL的PBS洗细胞一次,加入500uLPBS含50ug/mL溴化丙锭(PI), 100ug/mL RNase A,0.2% Triton X-100,4℃避光孵育30分钟。流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。7.细胞迁移实验：取生长良好无污染且处于对数期的细胞,细胞转染后48小时后,吸除原培养瓶中的培养基,加入灭菌的PBS洗液,轻轻漂洗。加入适量0.25%的胰蛋白酶,收集细胞,转移至无菌的离心管中离心,计数1×105个细胞,用100ul无血清培养基重悬,加入Transwell细胞培养板的小室上室,在下室加入600ul完全培养基。培养48小时后,取出小室,用棉签擦去上室的细胞,4%多聚甲醛固定2Omin, PBS洗涤一次,结晶紫染色10min, PBS洗涤一次,显微镜下观察细胞穿过小孔数目,并拍照统计。8.统计学方法：采用SPSS 13.0软件对实验数据进行统计分析。对正态分布的连续性变量采用(x±s)描述,非正态分布的连续性数据采用中位数(四分位数间距)描述。采用多个独立样本的非参数检验(Kruskal-Wallis H检验)比较RASGRF1在结直肠癌组织切片和结肠腺瘤、癌旁正常组织切片的表达情况。RASGRF1表达与结直肠癌患者临床病理参数之间的相关性采用两独立样本的非参数检验(Mann-Whitney U检验)及多个独立样本的非参数检验(Kruskal-Wallis H检验)。采用One-way ANOVA分析分别比较KRAS突变型结肠癌细胞HCT116 RASGRF1 siRNA 50nm组、RASGRF1 siRNA 100nm组、RASGRF1 siRNA 200nm组与阴性对照组的RASGRF1 mRNA表达水平之间的差异；采用重复测量数据的方差分析及One-way ANOVA分析分别比较KRAS突变型结肠癌细胞HCT116 RASGRF1 siRNA 24小时组、RASGRF1 siRNA 48小时组、RASGRF1 siRNA 72小时组与阴性对照组的细胞增殖变化的差异,当满足方差齐性时采用LSD法比较组间差异,当不满足方差齐性时采用Dunnett T3法比较组间差异：采用Kruslal-Wallis H检验分析KRAS突变型结肠癌细胞HCT116RASGRF 1 siRNA、阴性对照、HCT116细胞凋亡变化。应用Kruslal-Wallis H检验分析RASGRF1 siRNA组、阴性对照组、HCT1 16组处于G1期细胞差异；用One-way ANOVA分析分别比较RASGRF1 siRNA组、阴性对照组、HCT116组处于S期细胞差异,当满足方差齐性时采用LSD法比较组间差异,当不满足方差齐性时采用Dunnett T3法比较组间差异；HCT116 RASGRF1 siRNA、阴性对照、HCT116细胞组细胞迁移能力比较用Kruslal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.结肠癌组织、癌旁正常组织及结肠腺瘤组织中RASGRF1的表达情况RASGRF1阳性表达主要表现为胞浆中出现棕黄色或深棕色颗粒oRASGRF1蛋白在结直肠癌组织和癌旁正常组织、结直肠腺瘤组织均表达于细胞浆中,未见明显胞核染色。RASGRF1在结直肠癌组织、腺瘤组织及癌旁正常组织中表达有差异(P=0.038),癌组织高于腺瘤及癌旁正常组织,腺瘤组织高于癌旁正常组织。35例结直肠腺瘤中17例为管状腺瘤,18例为绒毛管状腺瘤,17例管状腺瘤组织切片中,二者在RASGRF1表达上差异无统计学意义(P=0.171)。2.结直肠癌组织RASGRF1表达水平与临床病理特征的关系进一步分析结直肠癌组织RASGRF1表达水平与结直肠癌临床病理参数相关性显示,RASGRF1蛋白表达与性别(P=0.021)、组织分型(P=0.009)、有无远处转移(P=0.019)及TNM分期(P=0.001)相关,女性高于男性；粘液腺癌、印戒细胞癌高于腺癌；有远处转移者高于无远处转移；TNM　Ⅲ、Ⅳ期高于TNMⅠ、Ⅱ期。与年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径、分化不相关(P>0.05)3.CCK8法检测RASGRF1下调后对结肠癌细胞HCT116增殖能力影响转染后48小时,三组增殖率差别有统计学意义(P=0.007),RASGRF1 siRNA组增殖速度慢于HCT116组,差异有统计学意义(P=0.005)；转染后72小时,三组细胞增殖有差异(P=0.000),与NC组及HCT116组相比,RASGRF1 siRNA组增殖速度明显减慢,差异有统计学意义(P=0.000及P=0.000);NC组与HCT116组间差别无统计学意义(P=0.333)。4.Annexin V-FITC/PI法检测下调RASGRF1后对HCT116细胞凋亡影响通过流式细胞仪检测了RASGRF1 siRNA转染后细胞凋亡情况,RASGRF1 siRNA组早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及总凋亡细胞均多于NC组和HCT116组(P=0.027),下调RASGRF1可增加细胞凋亡。5.下调RASGRF1后对HCT116细胞周期影响转染48小时后,通过流式细胞仪检测RASGRF1 siRNA对KRAS突变型结肠癌细胞株HCT116细胞周期的影响,结果显示：RASGRF1 siRNA组细胞处于G1多于NC组及HCT116组(P=0.039),表明下调RASGRF1后HCT116细胞阻滞于G1期。与NC组及HCT116组相比,RASGRF1 siRNA组处于S期细胞明显减少(P=0.000),下调RASGRF1后细胞分裂减少。6.下调RASGRF1后对结肠癌HCT116迁移能力影响Transwell细胞培养板培养48小时后RASGRF1 siRNA组穿过小室的细胞明显少于NC组及HCT116组,差异有统计学意义(P=0.003),NC组与HCT116组间比较无明显差异,下调RASGRF1后HCT116迁移能力下降。结论结直肠癌组织中RASGRF1表达水平高于结肠腺瘤及结直肠癌旁正常组织,且与结直肠癌病人性别、组织学分型、有无远处转移及TNM分期相关,与年龄、肿瘤部位、大小、组织学分型、分化等未见明显相关。下调KRAS突变型结肠癌细胞株HCT116的RASGRF1表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,细胞分裂减少及降低细胞迁移能力。