奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织受到内、外界环境中的刺激因素如物理、化学、微生物等因素刺激所产生的一种炎性反应,是奶牛生产中的常见病和多发病,而多种病原微生物混合感染是引起奶牛乳房炎发病的主要原因,严重制约了当前奶牛业的发展。奶牛场乳房炎的防控与治疗目前主要依赖抗菌药物,但由于长期和广泛使用抗菌药物,使得细菌耐药性增强现象普遍发生,导致乳汁中抗菌药物残留超标、环境污染严重及乳制品安全受到威胁等问题日益突出,引起了全社会的广泛关注。我国传统中草药具有天然性、多功能性、基本无耐药性、不易在畜禽及其产品中残留、毒副作用小和不污染环境等优点,在奶牛乳房炎防治中的应用越来越受到重视。其中,中草药黄连、黄芩及其复方制剂具有清热解毒、抑菌、抗病毒等作用,在临床上的研究和应用已成为热点。本研究收集陕西省部分地区奶牛场患临床型乳房炎奶牛乳样共95份,采用革兰氏染色镜检、生理生化试验、分子生物学特性检测等方法对其进行大肠杆菌的分离和鉴定;采用二倍稀释法对分离得到的大肠杆菌进行四组中药(黄连、黄芩、黄连黄芩(1:1)水煎剂及双黄连冻干粉针剂)体外抑菌试验;采用扫描电镜及酶标板法检测抑菌效果较好的黄芩和双黄连对细菌胞壁及细菌外观微形态的影响;进一步检测了所分离大肠杆菌对常用14种抗菌药物的耐药情况以及四组中药对大肠杆菌耐药性的消除作用,通过RT-PCR方法对比了四组中药对大肠杆菌所含耐药基因的影响,结果如下:本研究共分离得到大肠杆菌15株。四组中药对所分离15株大肠杆菌均有一定程度的体外抑制作用,药物体外MIC50测定结果显示,双黄连在所选中药中抑菌作用最强,其MIC50为3.90 mg/mL;其次是黄芩,其MIC50为7.81 mg/mL;然后是黄连和黄芩与黄连的组合,其MIC50为15.625 mg/mL。发射场电子扫描显微镜观察大肠杆菌胞体表面微观形态显示随着中药作用时间的延长,大肠杆菌胞体表面完整性破坏越发严重,说明中药黄芩和双黄连均对大肠杆菌有破坏作用;中药培养的大肠杆菌上清液中AKP随着中药作用时间的增加含量为上升趋势,表明中药黄芩和双黄连可增加大肠杆菌细胞壁的通透性,提示黄芩和双黄连主要通过对大肠杆菌细胞壁的破坏及菌体的分解破坏发挥抑制作用。15株大肠杆菌分离株对现阶段临床上普遍使用的大部分抗菌药物均表现出不同程度的耐药,其中对林可霉素、红霉素、青霉素的耐药率高达100%,而对头孢西丁、头孢噻肟的耐药率为0%。经中药培养后各组菌株敏感性普遍增强,其中以黄芩的作用最为显著;对单种抗菌药物(如万古霉素)耐药率降低最多的是黄芩(53%),其次是双黄连(40%)。15株大肠杆菌检测出β-内酰胺酶(Extended spectrumβ-lactamase,ESBL)基因型两种blaTEM和blaSHV,检出率分别为40%和13.3%;检测出质粒介导的喹诺酮耐药(Plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)基因型三种qnrB,qnrD和qnrS检出率均为13.3%。经中药作用后,耐药基因均呈现不同的减弱或消除,以黄芩对5种耐药基因的消除效果最好,黄芩黄连(1:1)次之。以上试验结果表明,黄连、黄芩、双黄连对临床型奶牛乳房炎乳源大肠杆菌具有一定的体外抑菌作用,黄芩、双黄连主要通过破坏大肠杆菌细胞壁完整性及分解破坏菌体发挥抑菌作用。药敏试验和分子生物学检测表明,中药黄连、黄芩、双黄连对大肠杆菌的耐药性和耐药基因均有不同程度的减弱或消除作用。