尿结石是犬临床上常见的疾病,据美国明尼苏达州结石分析中心报道,草酸钙尿结石在犬上的发病率从1981年到2007年已经从5%上升到41%,曾在犬上发病率最高的磷酸铵镁尿结石的发病率则从1981年到2007年从78%下降到了40%。而明尼苏达州结石分析中心最新公布2009年到2010年与1999年到2000年犬尿结石发病率相比,草酸钙尿结石有明显的升高。我国犬草酸钙尿结石的发病率近年来亦有升高的趋势。同时,在人上草酸钙尿结石也是发病率最高的尿结石类型。因此研究草酸钙尿结石的形成机理和防治有重要的理论和应用意义。国内外研究表明,高浓度草酸尿对细胞具有毒性损伤作用,尿液中草酸作用于肾小管上皮细胞后,可进一步引起上皮细胞膜脂质过氧化,释放氧自由基,造成上皮细胞的损伤,草酸钙晶体更易于粘附于受损伤的肾小管上皮细胞表面,最终导致草酸钙尿结石的形成。Grases等在体外通过模拟肾脏的条件,证明氧自由基可引起上皮细胞的损伤,损伤后的上皮细胞利于晶体的粘附、生长,而通过抗氧化治疗则可提高抗氧化能力,同时抑制了草酸钙晶体的形成。硒目前被认为是重要的抗氧化微量元素,它可保护细胞免受脂质过氧化损伤。硒包括有机硒和无机硒两种形式,有机硒与无机硒相比,具有毒性小,适口性好,吸收利用率高等优点。但硒特别是有机硒对草酸钙尿结石的形成有何影响?机制如何?国内外很少有研究。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种酸性糖蛋白,许多研究认为它是一种能抑制尿路结石形成的大分子有机物,可以参与细胞迁移、扰乱晶体的晶格,从而抑制草酸钙晶体的生长,但也有持相反观点的。迄今为止,未见在犬上研究肾组织中OPN表达和结石关系的报道。本研究对南京地区2009年1月-2011年12月临床上283个犬尿石症自然病例的发病情况进行了调查,对收集到的尿结石样品的成分进行了化学分析；建立了乙二醇诱导的犬草酸钙尿结石模型；研究了不同硒源对乙二醇诱导的模型犬尿结石形成的影响,测定了犬血液、尿液的相关生化指标和血液、肾脏的抗氧化指标,观察了肾脏组织的组织病理学变化,检测了肾脏OPN-mRNA和蛋白表达水平,目的是探讨硒特别是有机硒在阻止犬草酸钙尿结石形成中的作用和机理。本研究对草酸钙尿结石的发生机制和防治提供了一个新的研究思路。各试验的研究内容如下：试验1南京地区2009-2011年犬尿石症发病情况的调查收集南京地区2009年1月-2011年12月5家大型动物医院的犬结石标本283份,采用化学方法对尿结石中的主要成分进行分析,同时对尿石症患犬进行流行病学调查。结果表明,283份犬尿结石标本化学成分分别是：鸟粪石(磷酸铵镁)占38.16%(108/283),草酸钙占32.51%(92/283),尿酸及尿酸盐占18.73%(53/283),磷酸钙占3.18%(9/283),复合型结石占7.42%(21/283)。发现患尿结石犬中草酸钙尿结石的比例有明显升高；患尿石症犬的性别、品种、平均年龄和饮食习惯对结石的成分及发生部位都有一定程度的影响。这为该地区犬尿石症的防治和深入研究提供一定的科学依据。试验2乙二醇诱导的犬草酸钙尿结石动物模型的建立方法：采用0.5%和1%两种不同浓度乙二醇诱导犬草酸钙尿结石动物模型。选用1岁左右、体重大约为10 kg的本地公犬15只,随机分为正常对照组、0.5%乙二醇造模组、1%乙二醇造模组,三组均饲喂基础犬粮。检测1、9和18周时各组犬24h尿钙、尿草酸、尿尿素氮和尿肌酐以及血钙、血尿素氮和血肌酐浓度；收集尿沉渣进行化学定性分析、傅里叶红外光谱分析和扫描电镜观察。结果发现,在饮水中添加乙二醇后,尿比重显著增高(P<0.05),尿液pH值显著减小(P<0.05)；两组犬的血清钙较空白对照组均显著降低(P<0.05),且1%乙二醇组的血清钙较0.5%组的血清钙降低更显著(P<0.05)。乙二醇组的血清肌酐和尿素氮相对于正常对照组显著升高(P<0.05)。在整个试验期间,乙二醇组的尿草酸较空白对照组均显著升高(P<0.05),且1%乙二醇组的尿草酸均显著高于0.5%乙二醇组的尿草酸(P<0.05)。乙二醇组的尿钙较正常对照组显著升高(P<0.05)。乙二醇组的尿肌酐和尿尿素氮均显著低于正常对照组(P<0.05),且1%乙二醇组的尿肌酐和尿尿素氮显著低于0.5%乙二醇组(P<0.05)。尿沉渣结晶化学定性分析、傅里叶红外光谱分析和扫描电镜观察结果证明为草酸钙结晶。第18周,肾组织病理切片观察,正常组犬肾小管未见扩张和任何草酸钙晶体沉积；1%乙二醇组犬肾小管内有大量的结晶,互相连接,上皮细胞明显肿胀、变性、坏死,管腔扩张明显。0.5%乙二醇组犬仅有少数细小结晶分布,管腔扩张程度也较1%乙二醇组轻。说明1%乙二醇组的犬’肾脏出现结晶团,故可认为是造模成功。试验3不同硒源对乙二醇诱导的犬草酸钙尿结石形成及抗氧化能力的影响观察不同硒源对乙二醇诱导的犬草酸钙尿结石形成的影响,并从抗氧化方面探讨硒预防犬草酸钙尿结石形成的机制。方法：采用1%乙二醇溶液饮水建立犬草酸钙尿结石模型,20只1岁左右体重大约10kg的本地公犬随机分为正常对照组、草酸钙尿结石造模组、亚硒酸钠预防组和富硒酵母预防组,四组均饲喂基础犬粮(硒水平0.107mg/kg)。其中,亚硒酸钠预防组和富硒酵母预防组在饮用1%乙二醇溶液的同时,分别在基础犬粮中添加硒水平为0.3 mg/kg的亚硒酸钠和富硒酵母。四组在喂养18周后,取尿液分析尿草酸、尿钙、尿肌酐和尿尿素氮含量及尿沉渣进行化学定性分析和傅里叶红外光谱分析；取左侧肾组织制备石蜡切片,HE染色后观察结晶情况；取血液测定全血硒、血清中的钙、尿素氮和肌酐含量以及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平。取右侧肾组织测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平。结果表明,与正常对照组相比成石组的血钙降低,尿钙、尿草酸、血清肌酐和尿素氮含量增加,血和肾组织的MDA浓度升高、抗氧化酶活性降低；而给饮用1%乙二醇的犬补充硒后,其肾组织中的草酸钙结晶沉积明显减少,亚硒酸钠预防组和富硒酵母预防组的全血硒、血清钙含量均显著高于成石组,尿钙含量、血清肌酐、尿素氮含量、血和肾组织中的MDA含量显著低于成石组,而抗氧化酶活性均显著高于成石组；富硒酵母预防组血液和肾脏组织中的MDA含量显著低于亚硒酸钠预防组,而抗氧化酶活性均高于亚硒酸钠预防组,血清肌酐和尿素氮含量略显著低于亚硒酸钠预防组,全血硒、血清钙含量略高于亚硒酸钠预防组,尿钙略低于亚硒酸钠预防组。结论：适量补硒在一定程度上可减轻乙二醇诱导的犬草酸钙尿结石的生成,可提高犬机体的抗氧化能力,有机硒源(富硒酵母)的效果优于无机硒源(亚硒酸钠)。试验4不同硒源对乙二醇诱导的草酸钙尿结石犬肾脏OPN-mRNA及蛋白表达的影响研究不同硒源对乙二醇诱导的草酸钙尿结石犬肾脏OPN表达的影响,探讨OPN的表达与尿结石的关系。方法：20只1岁左右体重大约10kg的本地公犬随机分为正常对照组、草酸钙尿结石造模组、亚硒酸钠预防组和富硒酵母预防组,四组均饲喂基础犬粮(硒水平0.107 mg/kg)。其中,亚硒酸钠预防组和富硒酵母预防组在饮用1%乙二醇溶液的同时,分别在基础犬粮中添加硒水平为0.3 mg/kg的亚硒酸钠和富硒酵母。在喂养18周后,取肾组织应用荧光定量PCR和Western-blot测定OPN-mRNA和OPN表达。结果表明,与对照组犬相比,模型组犬肾组织中OPN的表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比,亚硒酸钠和富硒酵母能够显著降低犬肾脏OPN的表达(P<0.05),而且富硒酵母的效果好于亚硒酸钠。表明犬服用硒后,肾组织表达并分泌到尿液中的OPN显著降低,而富硒酵母组OPN的表达低于亚硒酸钠组,表明硒可以抑制草酸钙结晶形成,进而反馈降低OPN的表达,而富硒酵母优于亚硒酸钠。