研究背景：由严重创伤、肿瘤切除、先天性疾病、人工关节翻修术等各种原因引起的大段骨缺损在临床上常见,其治疗周期长,难度大,并发症多,致残率高,这无疑给患者增加了痛苦和花费。传统的治疗方法包括自体骨移植(游离或吻合血管)、异体骨移植及人工骨等。其中前者因不存在免疫排斥反应,且含具有骨诱导和骨转导作用的干细胞及生成因子,仍被认为是中等量骨缺损治疗的金标准。但当骨缺损区较大需要植入的骨量较多时自体骨往往不足,又增加了手术创伤和出血,延长了手术时间,而且自体骨组织移植后能获得血运而存活的功能细胞数量非常有限；异体骨移植及人工骨有排异反应、传染疾病、爬行替代缓慢等诸多不足之处,不是理想的治疗骨缺损的方法。目前,节段性骨缺损的治疗策略主要有3类：①成骨诱导因子：如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)等局部应用或与材料复合使用,②干细胞或祖细胞移植：将具有向成骨细胞分化潜能的种子细胞,如各种来源的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)等,移植于骨缺损处,③骨组织工程方法：基本模式为生物支架材料复合信号分子和／或干细胞。研究者最早将BMPs应用于动物实验及临床患者骨缺损的治疗,是目前最肯定的具有诱导成骨作用的生长因子,BMP-2是目前已知该家族中诱导成骨能力最强的骨生长因子之一,但在节段性骨缺损区血管网的缺乏可能导致BMP-2在骨愈合过程中失去作用良机,影响其治疗效果。虽然BMP-2有上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达,从而可间接诱导血管新生的作用,但赵建军等研究发现,应用BMP-2治疗骨缺损时,新生血管的密度在移植块周边区域较高,随着向移植块中央呈向心性减少,其认为BMP-2诱导的血管化进程取决于周围的血运状况,中央区域血运不充分,因而骨修复过程显得较缓慢。骨缺损的修复是一个受多种细胞因子和生物信息调控的连续复杂的过程,其中缺损区的血管再生早于骨再生,在没有血运到达的缺损区不可能有成骨活动。因此血管再生是这一过程中的关键环节,欲使大段骨缺损得以尽快修复,必须设法诱导血管网络尽早重建。随着组织工程技术的不断发展,学者们也试图应用这一方法来治疗大段骨缺损,并做了大量有益的工作。多种支架结构及干细胞已用于组织工程骨的研究中,然而同样发现血管再生是影响其应用的关键环节之一。与器官移植不同的是,移植的器官有完善的血管网络,吻合血管后可迅速恢复血供而成活并发挥生理功能。而移植的组织工程骨则缺乏血管系统,有证据表明,种子细胞的存活范围在血供弥散的150-200μm范围内,当组织团块体积大于3mm3就不能依靠组织液的弥散支持细胞的生存,必须通过血管的再生来实现氧和营养物质的供给,缺氧和营养匮乏将导致大量细胞在3天内迅速坏死或凋亡。可见血管新生和骨再生同样是应用组织工程技术治疗骨缺损时的两个最基本环节。体外构建的组织工程化骨,植入体内后同样必须迅速建立充分的血供,才能保证组织工程化骨的成活及骨缺损的理想修复,这在修复节段性骨缺损时显得尤为重要。也就是说,完善的血管网络是其存活并与宿主组织融为一体的基本的先决条件,组织工程化骨在体内的血管化速度和程度是决定和制约其修复骨缺损疗效的关键。血管生成是由多因素相互作用的复杂过程,基于人们对其机制的初步认识,这一领域的研究思路可概括为两个方面：①在体外构建组织工程化骨的同时,构建人工网状脉管系统,然后再植入体内修复骨缺损。②在缺损局部合理使用有利于血管生成的细胞因子或／和细胞。第一种方法难度较大,操作复杂。合理应用促血管生成的生长因子如VEGF等对血管新生有较好的作用。VEGF是最主要的血管生长调节因子,在诱导血管再生方面应用最多。VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,血管再生过程中其介导内皮细胞迁移、增殖以构建新生血管的管状结构。VEGF还能活化EPCs,并改善EPCs的功能。近期研究还表明,VEGF可能是骨骼发育、骨血管发生、骨折愈合过程中重要的调节因子,具有多方面的生物学功能,包括调节成骨细胞和软骨细胞的分化、成骨细胞的活性、具有促进成骨细胞增殖的丝裂原作用、诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的作用等。VEGF-165是VEGF-A中最多见、成血管作用最显著的一种异构体。但应用VEGF不足之处在于和材料复合后生物活性大大降低,而且VEGF局部含量不易调控,含量低时效果有限,而高含量的VEGF作用有诱发血管瘤、水肿、低血压和潜在肿瘤生长等危险。而应用基因治疗的方法可巧妙的解决这一矛盾,既可使VEGF维持在治疗水平,又可使其在一定时期内持续表达,从而更理想的促进血管新生。自Asahara于1997年发现内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)并证实其有成血管作用后,许多学者对其进行了大量的研究。EPCs能靶向迁移至缺血或血栓部位,促进并参与新生血管的形成,它还分泌多种促进新生血管生长的因子,如表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、IL-8、Ang-1和VEGF等,从而调节新生血管形成,在心脑血管疾病、四肢缺血性疾病、生物工程材料等诸多领域有着广阔的研究和应用前景,而将其应用在节段性骨缺损的修复则鲜有报道。研究证实,内皮祖细胞可被多种载体所携带的基因所转染,从而增强其治疗效果,该细胞在骨组织工程中的应用尚未见文献报导。因此我们设想,以携带具有明显成血管和成骨作用的VEGF-165基因的腺相关病毒转染骨髓来源的EPCs,检测目的基因的表达。然后将VEGF-165基因修饰的EPCs与清华大学自主开发研制的纳米人工骨(nHAC/PLA)材料复合以构建组织工程骨,观察其在治疗大鼠股骨节段性骨缺损中对血管生成和成骨的影响,从而评价其效果。目的：将人VEGF-165基因转染的大鼠内皮祖细胞(EPCs)种植于纳米羟基磷灰石／胶原／聚乳酸[nano-Hydroxyapatite/Collagen/Poly(L-Lactic Acid), nHAC/PLA]支架以构建组织工程骨,并探讨其在修复大鼠股骨节段性骨缺损中促进血管新生及新骨形成的作用。方法：本实验包括体内试验和体外试验两部分,其中体外试验方法如下：1. EPCs的分离、培养和鉴定：无菌条件下取3周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠的四肢长骨,以中性磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗松质骨和髓腔,将骨髓细胞悬液加于密度为1.083的Percoll分离液中,离心20-30分钟后吸取小心两层液体之间云雾状细胞层,以添加胎牛血清(FBS)的EBM-2培养基培养,并加入多种生长因子以利于扩增。传代后于不同时期用免疫组化方法行标志分子CD133、CD34和VEGFR-2鉴定,以低密度脂蛋白吞噬(LDL)和荆豆凝集素-1(UEA-1)结合实验进行功能鉴定。2.基因转染：以Ad5-hVEGF165-EGFP转染EPCs,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达以推测目的基因转染是否成功,并分别用RT-PCR和Western-Blot在基因转录和蛋白翻译两个水平上检测目的基因的表达。3.基因修饰的EPCs与nHAC/PLA支架复合：将种子细胞种植在经FN预孵过夜的支架材料上,于不同的时间点以扫描电镜(SEM)观察细胞在支架内的生长状态,并以MTT法检测种子细胞(hVEGF-165基因转染的EPCs组和空载病毒转染的EPCs组)在支架内的增殖情况。体外试验部分包括：1.大鼠股骨节段性骨缺损模型的制作和组织工程骨的植入：将80只体重约400g的雄性SD大鼠随机分为4组,在股骨中1/3处制作长约5mm的节段性骨缺损模型,分别移植hVEGF165/EPCs-nHAC/PLA (group A, n=20)复合物、空白载体转染的EPCs-nHAC/PLA(group B, n=20)、EPCs-nHAC/PLA(group C, n=20)或nHAC/PLA支架(group D, n=20)。2.骨缺损修复和成血管效果的检测：于不同的时间点行放射学Seeherman评分、HE染色进行组织学观察,以评价各植入物在骨缺损处的成骨能力。并行组织切片的CD34免疫组化染色,在镜下计数微血管密度,以评价各植入物的成血管效果。结果：经鉴定从大鼠骨髓分离培养的细胞为EPCs,表达标志性分子CD133、CD34和VEGFR-2;并能吞噬DiI标记的低密度脂蛋白,结合FITC标记的UEA-1而被双染。基因转染6小时后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经RT-PCR和Western Blot检测有目的基因表达,且在所检测的时间内表达逐渐增高。与nHAC/PLA支架复合后,SEM表明其在纤维连接蛋白(FN)预孵过的支架材料微孔内表面粘附、生长良好,接种2小时后开始伸出丝状伪足,并逐渐表现为梭形或是鹅卵石样外观,随着时间推移,伪足逐渐增多,在一些视野中尚可见细胞通过伪足相互连接。复合后24小时,这些细胞在支架内增殖并经孔隙相互桥接。MTT实验显示在支架内增殖好,随时间的推移,细胞数目持续增加。复合后2、4、6天时hVEGF-165基因转染的EPCs组的平均吸光度分别为：0.36±0.03vs0.52±0.04vs0.73±0.04,P均<0.001。在相同时间点,空载病毒转染的EPCs组的平均吸光度分别为：0.32±0.13vs0.49±0.08vs0.71±0.05,P均<0.001。在同一时间点两组比较无统计学意义,P均>0.05。将组织工程骨植入大鼠股骨节段性骨缺损处后,不同时间点的影像学分析表明,术后第6周,A组骨缺损区内有大量新骨形成,密度较高,并可见部分皮质连续；B和C组的骨缺损区有较多新骨形成,密度较低,皮质不连续；D组的缺损区新骨形成少。第12周,A组骨缺损区完全修复,皮质连续,大多可见髓腔再通；B和C组有大量新骨形成,密度增高,皮质部分连续,少数可见髓腔再通；D组缺损区新骨形成较多,未见骨皮质相连。骨缺损处的放射学评分在A组最高,B和C组高于D组,差异有统计学意义。骨缺损处组织学分析显示,在术后3周时,A组宿主骨之间纤维组织增生明显,少量炎性细胞浸润,可见少量软骨生成；6周时,A组新生骨较成熟,在支架的孔隙中有大量的新骨形成,支架降解较明显,但骨髓腔尚无再通；第12周时,A组的骨缺损区几乎完全修复,骨小梁成熟,皮质连续,可见较多的板层骨,大多可见髓腔再通,支架几乎完全降解。术后3周时,各组的平均微血管密度分别为：A组14.99±1.52、B组7.39±0.69、C组7.16±0.79、D组5.53±0.59,术后6周时,各组的平均微血管密度分别为：A组10.36±1.21、B组6.02±0.61、C组5.85±0.93、D组4.44±0.67,术后9周时,各组的平均微血管密度分别为：A组9.32±0.84、B组5.09±0.62、C组4.83±0.54、D组3.77±0.50,差异有统计学意义；组织学显示新骨形成及支架降解在A组最明显,B和C组优于D组。结论：hVEGF-165基因转染的大鼠EPCs与nHAC/PLA支架复合可成功构建组织工程骨,种子细胞在支架内能良好的粘附、生长并可持续增殖。植入大鼠股骨节段性骨缺损处,能明显促进血管新生和新骨形成,从而加速骨缺损的愈合,提示该复合物在促进血管生成和修复大段骨缺损方面可能有较大的应用潜力。