非酒精性脂肪肝(NAFLD)是以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的肝脏疾病,不断发展将导致脂肪性肝炎和肝硬化,是肥胖引发的主要代谢综合征之一。NAFLD的发病率呈现全球化趋势,已经超过病毒性肝炎成为我国第一大肝病,因此控制并改善NAFLD的发生发展已成为亟待解决的问题。国内外研究发现,药食用真菌多糖在改善代谢综合征方面具有独特的优势,对肠道菌群的调节作用也受到广泛关注及认可。本实验室前期研究发现虎掌菌作为一种珍稀名贵的野生食用菌,不仅美味可口营养丰富,而且其多糖组分具有调节免疫、抗氧化及抗肿瘤等药理作用,而虎掌菌多糖在抗肥胖及改善NAFLD方面的活性尚不清楚。本文通过建立肥胖小鼠模型、NAFLD小鼠模型、油酸(OA)诱导的LO2肝细胞损伤模型,从肠道微生态、内质网应激介导的炎症等多个角度出发,系统研究虎掌菌多糖改善NAFLD的作用及机制,以期为开发利用虎掌菌多糖用于功能食品或药品提供研究基础和数据支撑。主要的研究内容和结果如下:1.水提醇沉法制备虎掌菌多糖(SATP),并分析其总糖含量和蛋白质含量,检测SATP的IR吸收图谱与单糖组成。结果发现其总糖含量为84.28%,符合多糖的红外吸收特征;SATP主要由半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖组成,它们的摩尔比是24.2:8.39:3.29:1.00。2.通过建立高糖高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠模型,以体重增长、血脂水平、脂肪组织炎症及脂肪代谢关键酶的表达为指标,评价SATP的抗肥胖活性。结果表明,模型组小鼠表现出明显的肥胖特征;通过灌胃SATP(400、200、100 mg/kg)进行干预后,肥胖小鼠的过度体重增长与脂肪堆积得到控制,SATP能够提高小鼠对葡萄糖的耐受能力;下调TC、TG、NEFA的含量,上调HDL-C水平,改善HFD诱导的血脂异常情况。SATP还可以显著改善肥胖小鼠脂肪组织中巨噬细胞的浸润情况,并能通过抑制脂肪合成与脂肪细胞分化关键酶(ACC-1、PGC-1α)的表达发挥抗肥胖作用。3.建立HFD诱导的NAFLD小鼠模型,通过HE染色、油红O染色、Masson染色等病理组织学检查,并结合转氨酶、血脂、促炎因子、氧化应激等生化指标的测定,评价SATP保护HFD诱导的肝脏脂肪变性损伤的作用。结果显示,SATP可以明显改善HFD诱导的肝脏脂肪变性特征,如气球样病变、细胞坏死及炎性细胞浸润等;有效减轻肝脏内的脂肪堆积及进行性纤维化。SATP还可以下调转氨酶ALT与AST的异常表达,并能通过显著降低肝脏内脂质过氧化产物MDA与LPO的含量,提高抗氧化酶SOD与GSH-Px的活力改善氧化应激。此外,SATP可以有效降低NAFLD小鼠血清中过表达的促炎因子(IL-1β、TNF-α),保护脂肪变性引起的肝脏组织损伤。4.在NAFLD小鼠模型的基础上,基于肠道微生态深入探讨了虎掌菌多糖保护肝脏脂肪变性损伤的作用机制。通过HE染色、WGA-FITC法、内毒素检测等评价SATP对小鼠肠道粘膜机械屏障的保护作用;利用16S rRNA高通量测序技术分析各组小鼠肠道菌群的多样性;研究肝脏脂肪变性与肠道内短链脂肪酸(SCFAs)变化的相关性;采用粪便移植实验(FMT)分析SATP干预后的肠道菌群对NAFLD的影响。实验发现:(1)NAFLD小鼠的肠道粘膜机械屏障受损,小鼠血清中内毒素的水平显著提高,肠道的机械屏障功能出现障碍。SATP的干预可以维持小鼠正常的肠道粘膜屏障功能。(2)不同的饮食和干预方式可导致肠道微生物群落的不同发展;NAFLD小鼠肠道内的微生物多样性降低;NAFLD模型的肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门(F/B)的比例显著高于正常小鼠;SATP可以有效增加肠道菌群的多样性,下调F/B;而且能够显著上调Lactobacillus(乳酸杆菌属),Bacteroides(拟杆菌属)及Akkermansia(嗜黏蛋白阿克曼氏菌)等有益菌的丰度,改善肠道菌群的紊乱。(3)NAFLD小鼠的肠道内乙酸、丙酸、丁酸及总SCFAs的含量均显著下降;SATP的干预能够显著提高结肠内SCFAs的浓度,同样说明了对紊乱失衡的肠道微生态的重建作用。(4)移植NAFLD小鼠的肠道菌群,可加剧小鼠肝脏的脂质堆积,提高血脂与促炎因子的水平,引起肝功能异常;此外还会导致肠道粘膜屏障的受损。而移植SATP调节后的肠道菌群能够显著改善肝脏脂肪性损伤程度,保护肠道屏障功能。5.在体内模型的基础上,建立了OA诱导的LO2细胞损伤模型,测定了小鼠肝脏及LO2细胞的内质网应激相关因子的表达水平,并分析了OA诱导的LO2细胞内ROS的产生、内质网超微结构的变化、炎症因子的表达,更全面的探讨了SATP保护脂肪性肝细胞损伤的分子调控机制。结果表明,NAFLD小鼠肝脏及LO2细胞内的GRP78/Bip、CHOP等ER stress标志因子显著表达;OA可诱导LO2细胞内ROS过量产生,引起内质网超微结构的改变,提高促炎因子(IL-1β、TNF-α)的释放;SATP的干预能够显著下调肝脏及LO2细胞内ER stress标志因子的表达,抑制ROS的产生及炎症反应的激活;此外,SATP下调了p-IRE1α/IRE1α、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平,其保护机制可能与通过调节IRE1α/NF-κB通路抑制ER stress介导的炎症反应有关。