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卡托普利对内皮细胞活化与损伤的保护作用及其在急性肺损伤中治疗作用的研究前言急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)系由多种原因,如严重创伤和感染等肺内、肺外因素所致的急性缺氧性呼吸衰竭,其本质为急性肺损伤(acute lung injury,ALI),以微血管渗透性增加,间质、肺泡水肿和低氧血症为特征,目前仍是引起高死亡率的疾病之一(40-60%),并还缺乏有效的治疗办法。目前发病机制尚未明确,临床上缺乏敏感的早期诊断和病情监测指标及有效的治疗药物。因此,寻找特异而有效的药物成为该领域的研究热点,而利用传统己知的药物则成为理想的选择。在所有的组织器官中,肺是富含内皮细胞的器官,在ALI的发展过程中总是伴随着内皮细胞(endothelial cell,EC)的激活和损伤。研究显示,ALI中肺血管EC是受损的主要靶细胞,更是活跃的炎症细胞和效应细胞,在调节凝血、纤溶和血管紧张度方面发挥作用。循环内皮细胞(circulatingendothelial cell,CEC)是循环血中的血管EC,导致EC损伤的因素均可使CEC增多,CEC可直接而特异的反映活体内EC损伤情况,且主要反映了EC的脱落性损伤。近来研究显示,CEC的改变与器官功能障碍及血管损伤明显相关。新近的研究也发现,凝血异常与炎症反应密切相关,并直接影响预后。有作者认为内皮细胞的活化和损伤是ARDS的重要标志,在疾病复杂的病理机制中起重要作用,并且其程度与疾病的严重程度及预后密切相关。因此,怎样保护及逆转内皮细胞功能障碍成为ARDS治疗中一个新的发展趋势。卡托普利是一种血管紧张素转换酶抑制剂(angiotension convertingenzyme inhibitot,ACEI),主要用于心血管疾病的降压治疗,新近的研究认为其还具有其他良好的药理作用,除清除氧自由基、抗氧化损伤以外,还具有内皮细胞保护作用,而其机制除与抑制血管紧张素转换酶(angiotensionconverting enzyme,ACE)有关外,是否还存在其他机制目前尚未明了。我们通过体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察细菌脂多糖诱导HUVEC活化及损伤的状态下及在体油酸诱导大鼠急性肺损伤(ALI)过程中,在血管内皮活化及损伤状态下,探讨卡托普利的保护作用及其可能的机制。材料与方法一、实验材料(一)人脐静脉内皮细胞原代培养材料:健康新生儿脐带25~30cm,由沈阳市铁西区妇婴医院提供。(二)动物实验部分:Wistar大鼠72只,体重220~260g,中国医科大学实验动物中心提供。(三)临床实验对象:ICU、RICU内危重病患者21例,根据临床表现、体征、X线胸片、血气分析结果确诊为ALI或ARDS。ICU内对照者10例,健康对照者15例。二、实验步骤(一)细胞培养部分:1人脐静脉内皮细胞的培养:采用改良Jaffe等法。用0.25%的胰蛋白酶灌注消化脐静脉后,离心收集内皮细胞,接种于75cm2培养瓶,置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养培养液为含20%新生牛血清的DMEM。待细胞长满2/3瓶底后进行传代。Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性,证实为内皮细胞。2实验分组:实验分为3组:对照组:常规无血清DMEM培养;LPS组:1μg/ml LPS;Cap+LPS组:根据Cap浓度的不同(10-7mol/L、10-5mol/L及10-3mol/L)分为3个亚组,在每个亚组中LPS(1μg/m1)和Cap同时加入。3细胞培养上清血管假性血友病因子(vWF)的测定:用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组培养上清中vWF的抗原含量(%)。抗体为兔抗人vWF的单克隆抗体,方法按试剂盒说明书进行。4间接免疫荧光方法检测HUVEC的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)蛋白表达:各组HUVEC以PBS洗涤2次,0.25%胰蛋白酶消化,收集各组细胞,加入兔抗人ICAM-1多克隆抗体100μ1,37℃孵育1h,冷PBS洗涤3次,1000r/min,5min,离心去上清液,加入羊抗兔IgG-FITC 20μ1,室温避光反应90min,流式细胞仪测定每组细胞的平均荧光强度(MFI),以Cell Quest软件分析细胞膜表面ICAM-1蛋白表达。5原位杂交方法检测HUVEC的肿瘤坏死因子-α(TNFα)mRNA表达:按照TNFαmRNA原位杂交试剂盒操作方法进行。培养于盖玻片的各组内皮细胞用4%多聚甲醛室温固定20min。胃蛋白酶于37℃消化60s。37℃预杂交液4h,37℃杂交过夜。以2×SSC,0.5×SSC及0.2×SSC洗片,封闭液37℃封闭30min,生物素化鼠抗地高辛37℃孵育1h,SABC孵育20min,DAB显色20min-30min,苏木素轻度复染,封片。阴性对照用预杂交液替代探针工作液。镜下观察并采用MetaMorth/DP10/BX41型细胞图像分析仪进行TNFαmRNA的半定量分析。(二)动物实验部分:1分组:健康雄性Wistar大鼠按随机数字表随机分为对照组(C组)、ALI组(0A组)及Cap组(OA+Cap组)。OA组经颈静脉缓慢注射油酸(0.10 ml/kg);OA+Cap组在注入油酸后立即腹腔注入Cap(1.25 mg/kg),C组立即腹腔注射等量10%葡萄糖溶液。2肺损伤的评价:急性肺损伤通过动脉血气分析,肺组织学,肺干/湿比及肺泡灌洗液中细胞数量和蛋白含量测定来评价。3肺组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及核因子(NF)-κB蛋白表达的测定:肺组织石蜡切片ICAM-1及NF-KB免疫组化染色采用链亲和素-生物素复合物(SABC)法免疫组化试剂盒检测(武汉博士德公司)。ICAM-1阳性反应定。位于胞浆(呈棕黄色颗粒);NF-κB核阳性细胞为胞核呈棕黄色。每张ICAM-1免疫组化切片取5个不重复高倍视野,用MetaMorth/DP10/BX41型图象分析仪测其吸光度(A)值,取其平均值反映ICAM-1表达情况。每张NF-κB免疫组化片取5个不重复高倍视野,计算出NF-κB核阳性率(核阳性率=核阳性细胞数/总细胞数),以反映活化程度。4循环内皮细胞(circulating endothelial cell,CEC)的分离和计数:CEC的检测采用Percoll密度梯度离心法。按Mbithe Mutunga法并稍做调整。每组动物观测时间结束前留取枸橼酸钠抗凝静脉血3mL,加入3mL生理盐水后轻轻倒置混匀,向试管中加入1.6mL 100%Percoll悬液,室温下1000r/min,离心10min,取中层液1mL计数用。其上清取出到另一试管中,3000r/min,离心20min后弃上清,加入0.5mL生理盐水,强烈震荡5min,取上层提取液和中层各1小滴分别加入血细胞计数池内,在光镜下计数全部9个大方格中的CEC数,以每0.9μL的细胞数表示,显微镜下观察细胞形态后照相。CEC的鉴定用Ⅷ因子相关抗原抗体进行免疫组化染色得到证实。5血浆纤溶酶原激活物(tPA)及纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)活性的检测:血标本的留取同步骤4。tPA及PAI-1活性的检测采用发色底物法测定,结果分别以IU/L及AU/L为单位表示(三)临床实验部分:1标本采集:所有血标本均在确诊后24 h内通过静脉留置针留取并及时检测。2血CEC检测:方法同动物实验部分所用方法,Nikon UFX-Ⅱ型显微镜观察细胞形态后照相。3血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FG)、纤维蛋白原降解产物(fibrin degradationproducts,FDP)及D-二聚体的检测:PT及APTT测定采用凝固法;FG测定采用Clouse法;FDP测定采用胶乳凝集法;D-二聚体测定采用ELISA法。4血气分析的检测:动脉血2mL,美国AVL-OMNI V型血气分析仪测定pH值、动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)。结果1、ELISA及间接免疫荧光法检测的结果提示暴露于1μg/ml LPS后,HUVECs的vWF及ICAM-1表达明显强于对照组,加入Cap后,随Cap浓度增加明显下调LPS升高的HUVECs的vWF及ICAM-1表达,至Cap为10-3mol/L时,其vWF与ICAM-1表达与LPS组有明显差别(P<0.05)。Cap抑制LPS升高的HUVECs的vWF及ICAM-1表达呈一定的浓度依赖方式。2、原位杂交显示Cap10-5 mol/L及10-3 mol/L时表现明显下调HUVECs的TNFαmRNA表达,与LPS组比较差异明显(P<0.05,P<0.01)。3、与对照组比较,给予油酸2h后各时相ALI组氧合指数出现明显下降,CECs数量明显增加;Cap干预后,各时相Cap组氧合指数明显增加,CECs数量明显减少,氧合指数的变化与CECs数量的变化明显负相关(r=-0.7602,P<0.05=。4、给予油酸后,OA、OA+Cap两组的tPA较对照组明显下降,而PAI-1明显升高;Cap干预后,2h后PAI-1出现明显下降,4h后tPA出现明显升高,与对照组比较差异不明显(P>0.05)。5、OA+Cap组肺组织NF-KB核阳性率及ICAM-1表达显著高于对照组,但明显低于OA组(P<0.05,)。肺组织ICAM-1表达与NF-KB核阳性率呈明显正相关(r=0.7861,P<0.05)。6、ALI和ARDS组患者CEC数量明显高于健康对照组和ICU内对照组(P<0.05),且ALI及ARDS组CEC数量与其APACHEII评分明显相关(r=0.55,P<0.05及r=0.62,P<0.05),与LIS明显相关(r=0.60,P<0.05及r=0.53,P<0.05);并且CEC数量与PaO2明显负相关(r=-0.49,P<0.05及r=-0.64,P<0.05)。7、ALI和ARDS组患者FDP和D-二聚体较健康对照组及ICU内对照组明显增加(P<0.05),ARDS组患者FG较健康对照组及ICU内对照组明显增加(P<0.05),ALI组患者FG较健康对照组明显增加(P<0.05)。结论1、卡托普利对脂多糖诱导的HUVEC的活化及损伤有拮抗作用,其机制可能与卡托普利发挥直接的抗炎作用有关。2、卡托普利对油酸所致的ALI大鼠血管内皮细胞损伤有一定的保护作用,其机制可能与卡托普利改善凝血系统的失衡及发挥直接的抗炎作用均有关系。3、ARDS患者存在的血管内皮损伤可能在其复杂的发病机制中起重要作用。循环内皮细胞及凝血、纤溶指标可作为评价ARDS患者疾病严重程度及肺损伤程度的监测指标,指导临床治疗。