背景近年来,随着广谱抗生素的大量使用,致病力原本不强的条件致病菌嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia,SMA)已然成为医院感染的重要病原菌,致使感染率不断上升,导致免疫力低下或长期大量使用广谱抗生素的人群呼吸道感染、心内膜炎及败血症等危及生命的严重感染。体外药敏试验结果证实,嗜麦芽窄食单胞菌对磺胺类、β内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类等几乎所有抗生素均可产生耐药性(Resistance)。因此,目前国内尚无学者对嗜麦芽窄食单胞菌的感染提出统一的治疗方案,一些学者的推荐方案仅基于回顾性研究和病例报告,但嗜麦芽窄食单胞菌耐药突变快速,因此其实用价值有限。国外学者推荐的治疗方案也常有悖于药敏试验结果和临床治疗结果,故对于该菌的治疗,国内外一致提倡根据药敏结果选择敏感抗生素进行治疗。但临床实践证明,即使根据药敏结果选用抗生素,甚至联合几个同时敏感的抗生素进行治疗也不能使感染完全得到控制,这就是临床上治疗该菌时常见的体外药敏试验结果与临床治疗结果不一致的现象,导致大量患者因不能有效控制感染而死亡。但对于这类常见现象,国内学者长期以来不予重视,只是认为由于该菌生长缓慢而突变迅速造成了该结局,并未对其进行深入研究。试验证明,该菌生长并不缓慢而是生长很快,并且如果发生了耐药遗传物质突变应该能从基因水平得以证实,但至今未见到该菌由于基因突变致使体外敏感性与临床疗效不一致的报道。国外学者对其他革兰阴性菌研究时发现,不同类型的多种抗生素皆可诱导敏感菌产生暂时性耐药,本文按国外惯用定义称为适应性耐药。这种耐药形式可导致细菌耐药表型暂时转变,并认为这种耐药性使敏感菌疗效不佳,即适应性耐药引起敏感菌治疗效果低下,但该现象一直未得到重视。这种耐药性和有耐药遗传物质介导的耐药性不同,它不涉及基因组突变,因此临床微生物实验室不能检测出来,更不知其发生规律,无法报告临床。在特定条件下,敏感的嗜麦芽窄食单胞菌能否产生适应性耐药,这种耐药有无规律,其发生机制是什么,阐明这些,可为临床治疗嗜麦芽窄食单胞菌敏感株作出提示,避免适应性耐药发生。嗜麦芽窄食单胞菌中Ⅰ型整合子介导的复方新诺明耐药基因的发现,将导致该抗生素耐药传播迅速,其应用会受到限制。喹诺酮类治疗嗜麦芽窄食单胞菌时易诱发敏感株突变,造成多种抗生素耐药致使治疗失败。可见,该菌本身耐药变迁快速,耐药机制复杂,不同医疗机构根据当地耐药监测结果选择符合当地耐药特点的抗生素进行治疗,所以各地治疗方案不尽相同。而对于由该菌引起的危及生命的严重感染,除了采用国外推荐的复方新诺明和喹诺酮类治疗外,仍有很多地方根据药敏报告采用阿米卡星或庆大霉素联合其他抗生素进行治疗。鉴于上述原因以及中国药品管理局(SDA)规定和参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)常规药敏实验报告时假单胞菌的选药指南,本文选用对庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星和复方新诺明皆敏感的嗜麦芽窄食单胞菌,对其诱导处理后,再检测其能否对原本敏感的上述四种抗生素产生耐药性,产生规律及初步探讨其耐药机制。目的(1)筛选出左氧氟沙星,复方新诺明,庆大霉素和阿米卡星表型敏感且不含抗庆大霉素和阿米卡星修饰酶基因的敏感菌作为受试菌。(2)分别测定受试菌对庆大霉素、阿米卡星、复方新诺明和左氧氟沙星的最低抑菌浓度值(MIC)和最低杀菌浓度值(MBC)。(3)诱导受试菌适应性耐药,检测处于适应性耐药期细菌的广谱耐药性。(4)测定不同耐药时期菌体内抗生素含量。(5)测定不同耐药时期菌体外膜蛋白构成,对有差异的蛋白进行序列测定,确定有差异的蛋白类型。方法(1)用K-B法对收集到的88株嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株做药敏试验,筛选出对庆大霉素、阿米卡星、复方新诺明和左氧氟沙星敏感株。再用7对抗庆大霉素和阿米卡星的修饰酶基因引物对全部株进行扩增,收集不含任何一种氨基糖苷修饰酶基因且4种抗生素全为敏感的菌株作为受试菌。用液体稀释法测定受试菌对上述4种抗生素的MIC值和MBC值;(2)将受试菌因为处理方法不同分为试验组和对照组,对照组只是在诱导阶段不加抗生素诱导即空白诱导,其余处理与试验组完全相同。以1×MIC庆大霉素/阿米卡星分别诱导试验组细菌1h,再以4×MIC浓度的庆大霉素/阿米卡星杀菌1h,计算杀菌速度,比较试验组平均杀菌速度和对照组平均杀菌速度大小。若抗生素对试验组的杀菌速度小于对对照组的杀菌速度表示诱导使细菌产生了耐药性;如果两组杀菌速度相同则诱导不产生耐药性;如果对试验组杀菌速度大于对照组杀菌速度表示诱导使试验组细菌产生了敏感性。以阿米卡星诱导细菌后,再分别用复方新诺明/左氧氟沙星进行杀菌,证实诱导菌能否使复方新诺明/左氧氟沙星敏感性降低。(3)鉴于测定抗生素含量费用昂贵,故本试验只检测01号菌诱导后第2、4、6、8、10h吸收庆大霉素和阿米卡星的量来评价诱导后不同时段(第2、4、6、8、10h)抗生素进入菌体的情况。具体操作如下:一边做诱导试验(诱导试验同前),一边同步收集诱导后第2、4、6、8和10h并加入了抗生素至终浓度为10μg/ml,且杀菌1h的细菌。当诱导试验结果证明诱导耐药成功后,所收集的细菌方能用于测定抗生素含量。离心去除培养上清,PBS(pH 7.0)洗涤沉淀2次,去除PBS后再加新的PBS混匀细菌悬液,超声破菌。取超声后的菌液一滴涂片染色,镜下确定全部菌体都破裂。离心收集上清,上清液中的抗生素含量就是不同耐药时期的细菌吸收至体内的抗生素。采用高效液相色谱法测定此液体中的抗生素含量;(4)Carlone法提取受试菌诱导后第1h～第10h的外膜蛋白(outer membraneprotein,OMP),聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析OMP的构成成分;对有变化的外膜蛋白溶液送交蛋白测序公司进行氨基酸序列测定,测序结果在GeneBank中进行序列同源性比对,确定所测外膜蛋白的种类。结果(1)K-B法和PCR法筛选出符合条件的受试菌3株,分别命名为01、02、03号菌株。01、02、03号菌对各抗生素的最低抑菌浓度(MIC)值(μg/ml)和最低杀菌浓度(MBC)值(μg/ml)分别如下:庆大霉素的MIC值分别是0.5、1、0.5;庆大霉素的MBC值分别是1.5、2.5、1.5;阿米卡星的MIC值分别是0.25、0.5、0.5;阿米卡星的MBC值分别是0.5、1.5、1;复方新诺明的MIC值分别是0.25、0.25、0.25;复方新诺明的MBC值分别是0.5、0.5、0.5;左氧氟沙星的MIC值分别是0.25、0.25、0.5;左氧氟沙星的MIC值分别是0.5、0.5、1;(2)诱导后试验组细菌对4种抗生素均产生耐药性,即从诱导后第4h～第8h抗生素杀菌能力减弱甚至失去杀菌力即产生了适应性耐药。从诱导后第9h以后,抗生素开始逐渐恢复杀菌能力即细菌逐渐失去耐药性又变为敏感菌。对照组细菌没有这种规律性变化;(3)01号菌试验组细菌在诱导后第2、4、6、8和10小时的庆大霉素含量(gg/m1)情况分别是:1.69、0.81、0.32、0.71和1.57;对照组细菌诱导后第2、4、6、8和10小时的庆大霉素含量(μg/ml)情况分别是:1.71、1.76、1.69、1.73和1.8。01号菌试验组细菌在诱导后第2,4,6,8和10小时的阿米卡星含量(μg/ml)情况分别是:1.56、0.66、0.29、0.59和1.37;对照组细菌诱导后第2、4、6、8和10小时的阿米卡星含量(μg/ml)情况分别是:1.73、1.75、1.69、1.74和1.79。(4)收集诱导后不同时段的细菌,分别提取其外膜蛋白(outer membraneprotein,OMP),SDS-PAGE电泳显示耐药高峰期试验菌在45kD处及60kD的OMP表达几乎消失;对45kD处及60kD的OMP进行氨基酸序列测定,测定序列与美国国家生物信息中心的蛋白序列进行比对。结果显示,45kD处的蛋白与提交到生物信息中心的该菌的氨基酸运输跨膜蛋白完全同源(amino-acidtransporter transmembrane protein),全长475aa;60kD处的外膜蛋白测序结果与生物信息中心报道的该菌外膜上的转运蛋白(putative transfer protein)完全同源,全长823aa。结论(1)庆大霉素和阿米卡星能诱导嗜麦芽窄食单胞菌产生适应性耐药,试验用的4种抗生素皆对适应性耐药期细菌的杀菌能力减弱。由于受试菌没有耐药基因,可见没有耐药基因的变化,耐药表型也能发生变化,即嗜麦芽窄食单胞菌中,耐药不完全由耐药基因决定;(2)该菌中,某些耐药表型是动态变化着的,其转变有时限性,即经过一定时间之后,其表型又可回复到始发状态,揭示了该菌耐药的复杂性和传统耐药性检测的粗糙;(3)诱导后细菌吸收抗生素的变化步调与细菌发生适应性耐药步调基本一致,提示耐药表型的变化与抗生素在菌体内的含量有关;(4)45kD处及60kD处OMP的表达变化规律与适应性耐药的发生步调基本一致,与抗生素进入菌体内的变化规律也基本一致,其氨基酸序列比对显示,这两个OMP都是转运物质进入细菌体内的相关成分蛋白,而受试菌中不含耐药基因,进一步提示45kD处及60kD处的OMP与适应性耐药的产生有密切关系。