背景:游离皮瓣移植（Free Skin Flap Grafting,SGF）是整形外科修复组织缺损畸形和器官再造的重要手段和方法。缺血再灌注（Ischemic Reperfusion,I/R）是组织游离移植过程中不可避免的病理过程,在对发生血管危象皮瓣进行探查及二次吻合的过程中,缺血再灌注损伤更为常见,严重影响皮瓣的成活率和存活质量。在缺血再灌注损伤治疗研究领域,缺血后处理（Ischemic Postconditioning,IPo）和远程缺血后处理（Remote Ischemic Postconditioning,RIPo）是目前基础及临床工作关注的热点。在对心、脑、脊髓、肺、肾等再灌注模型的研究中,IPo及RIPo对组织缺血再灌注损伤的保护作用逐渐被证实,部分的研究成果已被应用于临床缺血再灌注的预防和治疗,但其具体的作用机制至今尚不清晰。miR-21是近年来被发现在缺血再灌注损伤过程中具有重要保护作用的miRNA。既往研究中发现,缺氧诱导因子-1a（Hypoxia Inducible Factor-1a,Hif-1a）能够在缺氧早期促进细胞内miR-21表达,后者能够通过靶向抑制其下游的促凋亡基因起到抑制细胞凋亡的作用。目的:本研究拟通过构建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型,探讨原位缺血后处理和远程肢体缺血后处理对皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用,以及对Hif-1a蛋白和一系列组织缺氧相关miRNA的表达调控。在体外实验中,研究拟采用过氧化氢（hydrogen peroxide,H₂0₂）作为外源性自由基生成系统,建立体外血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）氧化应激损伤模型,探讨miR-21过表达对VSMC在氧化损伤中的抗凋亡作用,及其对凋亡诱导蛋白PTEN的表达调控。同时,通过对临床游离皮瓣缺血及再灌注组织样本的检测,研究拟进一步明确miRNA表达与人体皮瓣缺血再灌注损伤的相关性。方法:1.构建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型:（1）设计以腹壁浅动脉为蒂的大鼠腹壁岛状瓣模型,按缺血时间（0小时,4小时,6小时,8小时,12小时）将50只SD大鼠随机分为5组;（2）硫代巴比妥酸法再灌注24小时检测各组皮瓣组织中丙二醛（MDA）含量,黄嘌呤氧化酶法检测各组皮瓣组织中氧化物歧化酶（SOD）活性;（3）再灌注第7天分析皮瓣成活区域和坏死区域面积,计算皮瓣存活率;（4）实时逆转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）检测缺血8小时,再灌注2小时,再灌注12小时,再灌注24小时,Rno-miR-1,Rno-miR-133,Rno-miR-210,Rno-miR-21,Rno-miR-200c及Rno-miR-92a在大鼠皮瓣及血管组织内的表达;2.体内研究缺血后处理对皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用:（1）设计以腹壁浅动脉为蒂的大鼠腹壁岛状瓣缺血再灌注模型,将40只SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）,对照组（NC组）,缺血后处理组（Isc组）,远程肢体缺血后处理组（Rem-Isc组）,每组10只;（2）硫代巴比妥酸法检测再灌注24小时各组皮瓣组织MDA含量,黄嘌呤氧化酶法检测各组皮瓣组织SOD活性;（3）免疫组化法（IHC）检测再灌注第3天各组皮瓣组织内Hif-1a蛋白表达;（4）免疫印迹法（Western Blot）检测再灌注第3天及第7天血管组织内Hif-1a蛋白表达;（5）实时逆转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）检测再灌注2小时,再灌注12小时,再灌注24小时,Rno-miR-21及Rno-200c在大鼠皮瓣及血管组织内的表达;（6）再灌注第7天对大鼠皮瓣进行拍摄,测量各组皮瓣成活区域和坏死区域面积,计算皮瓣存活率;3.体外研究miR-21对血管平滑肌细胞氧化损伤的保护作用:（1）组织贴块法培养原代大鼠动脉血管平滑肌细胞（VSMC）,免疫荧光鉴定平滑肌标志蛋白a-Actin表达,体外构建过氧化氢（H₂0₂）诱导的细胞氧化损伤模型;（2）通过lipofectine2000?脂质体转染miR-21模拟物以及miR-21抑制剂,在VSMC内过表达miR-21或抑制miR-21表达;实验随机分组:NC组;H₂0₂组;miR-21 mimics+H₂0₂组;NC₁ mimics+H₂0₂组;miR-21inhibitor+H₂0₂组;NC₂+H₂0₂组;miR-21 mimics组;NC₁ mimics组;miR-21inhibitor组;miR-21 inhibitor组;（3）CCK-8法检测VSMCs处理后24小时和48小时细胞活力;（4）Western Blot检测处理后48小时各组细胞内PTEN蛋白、Pre-CASP3蛋白以及cleaved-CASP3蛋白表达;（5）免疫荧光鉴定VSMCs处理后24小时细胞内a-Actin蛋白表达;（6）PI/HO染色鉴定VSMCs处理后24小时细胞凋亡率;4.游离皮瓣乳房重建术患者相关数据分析:（1）分别于术前及术后6月对126名游离皮瓣乳房重建患者进行RSES、PHQ-9、GAD-7等自我评估量表检测,并对结果进行比较分析;（2）术中采集6名行游离腹壁下动脉穿支皮瓣（DIEP）乳房重建术患者的正常（N组）、缺血（I组）及再灌注后（R组）DIEP皮瓣边缘组织样本,real-time RT-PCR检测组织中miR-210,miR-21,miR-200c及miR-92a相对表达。结果:1.构建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型:（1）术后第7天,缺血0小时组、4小时组、6小时组、8小时组、12小时组的皮瓣存活面积依次为98.1±1.6%、92.6±7.4%、87.1±14.0%、54.6±13.4%、24.2±11.1%。方差分析结果显示,各组皮瓣存活面积具有显著性差异（P<0.05）;（2）再灌注24小时各组皮瓣组织内MDA含量依次为38.0±5.8 nmol/g、72.9±17.0 nmol/g、103.8±10.9 nmol/g、171.7±4.7 nmol/g、165.1±10.5 nmol/g,皮瓣组织中SOD活性依次为93.2±12.8 U/g、76.9±9.9 U/g、56.7±7.3 U/g、37.6±6.0 U/g、26.1±6.5 U/g;方差分析结果显示,各组皮瓣组织中MDA含量及SOD活性均具有显著性差异（P<0.05）;（3）与缺血前相比,血管组织及皮瓣组织内Rno-miR-21和Rno-miR-200c在缺血再灌注再灌注2小时,再灌注12小时,再灌注24小时,表达均显著升高;2.缺血后处理对皮瓣缺血再灌注损伤保护作用的体内研究:（1）与NC组相比,Isc组与Rem-Isc组再灌注第7天皮瓣存活面积显著升高（P=0.034,P=0.049）;（2）与NC组相比,Isc组与Rem-Isc组再灌注24小时皮瓣组织内MDA含量显著下降（P=0.011,P=0.014）,SOD活性显著升高（P=0.020,P<0.01）;（3）免疫组化结果显示,与NC组相比,Isc组与Rem-Isc组再灌注第3天皮瓣组织内Hif-1a蛋白阳性表达显著升高;（4）Western Blot结果显示再灌注第3天与第7天,Isc组皮瓣血管组织Hif-1a蛋白表达与NC组相比均显著升高（P<0.01,P<0.01）;Rem-Isc组皮瓣血管组织Hif-1a蛋白表达与NC组相比均显著升高（P<0.01,P<0.01）;（5）与NC组相比,再灌注24小时内,Isc组与Rem-Isc组皮瓣组织及血管蒂组织内Rno-miR-21表达均显著升高;与NC组相比,Isc组血管蒂组织内Rno-miR-200c仅在再灌注12小时后表达上调,Rem-Isc组则无明显改变;3.体外研究miR-21对血管平滑肌细胞氧化损伤的保护作用:（1）与NC组相比,H₂0₂组VSMC细胞内α-actin蛋白表达显著减少（P<0.01）;与NC₁+H₂0₂组比较,miR-21 mimics+H₂0₂组VSMC细胞内α-actin蛋白表达呈一定程度的升高趋势,但差异无显著性（P=0.073）;与NC₂+H₂0₂组比较,miR-21 inhibitor+H₂0₂组VSMC细胞内α-actin蛋白表达量显著下降（P=0.049）;（2）Western blot结果显示,与NC组相比,H₂0₂组VSMC细胞Pro-CASP3、cleaved CASP3蛋白表达显著增高（P=0.011,P<0.01）,PTEN蛋白表达量下降（P=0.028）;与NC₁+H₂0₂组比较,miR-21 mimics+H₂0₂组细胞内PTEN蛋白表达量显著下降（P<0.01）,Pro-CASP3蛋白表达无明显改变,cleaved CASP3蛋白表达显著降低（P=0.014）;与NC₂+H₂0₂组比较,miR-21 inhibitor+H₂0₂组VSMC细胞内PTEN蛋白表达量显著增加（P<0.01）,Pro-CASP3蛋白表达无明显改变,cleaved CASP3蛋白表达显著增高（P=0.027）;（3）CCK-8结果显示:H₂0₂组细胞培养孔450 nm 24小时与48小时OD值均显著低于NC组（P<0.01,P<0.01）;miR-21mimics+H₂0₂组在24小时与NC₁ mimics+H₂0₂组相比450 nm OD值没有显著改变,48小时OD值较NC₁ mimics+H₂0₂组显著增高（P=0.013）;miR-21 inhibitor+H₂0₂组在24小时与NC₂ inhibitor+H₂0₂组相比450 nm OD值没有显著改变,48小时OD值较NC₂ inhibitor+H₂0₂组显著降低（P=0.016）;（5）与NC组相比,H₂0₂组VSMC细胞核PI染色比例显著升高（P<0.01）;与NC₁+H₂0₂组比较,miR-21 mimics+H₂0₂组VSMC细胞核PI染色比例显著下降（P=0.048）;4.游离皮瓣乳房重建患者临床数据分析:（1）与术前相比,游离皮瓣乳房重建术后患者平均RSES评分显著升高（P<0.01）,PHQ-9平均评分显著降低（P<0.01）,GAD-7平均评分无明显改变;（2）术后6个月随访结果提示,DIEP游离皮瓣乳房重建患者Alderman满意度评分为27.6±6.3分,切术后RSES评分（P<0.01）、术后RESE评分改变值（P<0.01）、术后GAD-7评分（P<0.01）以及术后GAD-7评分改变值（P<0.01）与Alderman评分线性相关;（3）与正常皮瓣组织相比,缺血90分钟后人体皮瓣组织中miR-21,miR-210,miR-92a、miR-200c的表达均无显著性差异;与正常皮瓣组织相比,再灌注90分钟后皮瓣组织中miR-21（P=0.02）,miR-200c（P=0.03）表达显著上调,miR-210,miR-92a表达无显著性差异。结论:（1）缺血后处理和远程肢体缺血后处理能够减轻缺血再灌注后氧自由基对皮瓣的损伤,增加缺血后皮瓣存活面积;（2）Hif-1蛋白表达及miR-21的表达上调可能参与了缺血后处理和远程肢体缺血后处理对皮瓣缺血再灌注干预的作用机制;（3）H₂0₂处理VSMC能够在体外模拟细胞氧化应激损伤,使细胞内MDA含量升高,SOD活性下降,细胞活力减弱,细胞凋亡增加;（4）外源性细胞内高表达miR-21能够降低H₂0₂诱导的VSMC细胞凋亡,提高其细胞活力,反之抑制内源性miR-21表达会促进H₂0₂诱导的VSMC细胞凋亡,降低其细胞活力,其机制可能与miR-21靶向抑制凋亡诱导基因PTEN的蛋白表达有关。