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玉米秸秆中含有大量的纤维素,是全球最丰富、应用价值也非常高的可再生资源,但是这种资源长期没有得到合理的开发。我国每年产玉米秸秆约2.65亿t,但是除了少部分被用于饲料外,大部分经焚烧还田,造成了大量资源浪费及大气污染。论文采用DNS法、苯酚硫酸法每隔2 d检测处于自然发酵的玉米秸秆发酵液中的还原糖与总糖含量;并用第二代测序技术,研究玉米秸秆自然发酵过程中细菌群落结构的变化。研究发现,随发酵时间的延长,发酵液中的还原糖与总糖含量均呈现出下降-上升-下降的趋势;测序共获得80575条有效序列,共分为3307个OTU序列,涉及细菌的18门,194属。细菌群落多样性分析表明,玉米秸秆自然发酵过程中,样品中细菌群落多样性和微生物丰度显著提高,但在后期略有降低;微生物群落组成分析发现,在发酵中后期,拟杆菌门(Bacteroidetes)的菌群明显增加,变形菌门(Proteobacteria)菌群持续减少,厚壁菌门(Firmicutes)呈现先下降后上升的趋势;发酵末期菌属的数目相对于发酵初期增加了69.3%。研究表明,参与秸秆自然的细菌多样性极为丰富,且在不同时间段,出现不同的优势菌群。利用刚果红染色法从自然发酵的的玉米秸秆中分离到1株高产纤维素酶的菌株Bacillus subtilis DX4(BS-DX4),其滤纸酶活(FPA酶活)、内切葡聚糖酶活力(CMC酶活)和外切葡聚糖酶活力(Cex酶活)分别为256.051、358.276和5.536 U/ml;BS-DX4的最适生长温度为40℃,最适生长pH为7.0,低盐浓度下生长旺盛,具有良好的开发应用前景。通过单因子实验筛选得到3个具有显著效应的因子:发酵温度、发酵时间、发酵pH。以纤维素内切酶为响应值进行响应面分析,最终得到最佳发酵条件为:最佳碳源麸皮10 g/L,最佳氮源黄豆粉10 g/L,发酵温度为31℃,发酵时间为123 h,发酵pH为7.0。验证模型发酵条件得到的CMCase为523.59 U/mL,与模型预测值546.53 U/mL接近,并且比初始培养基酶活提高了46.14%。基于保守序列克隆法,设计引物并通过PCR克隆BS-DX4的β-1,4内切葡聚糖酶基因。获得1条1564 bp的序列,其中包含一个长达1527 bp的完整开放阅读框(ORF),编码由508个氨基酸残基组成的肽链,分子量为56.53 KDa,理论等电点为8.93。序列分析表明,该基因编码蛋白具有N端跨膜信号,第1-38位氨基酸有信号肽,为分泌蛋白;包括两个保守结构域,GH5家族与CBM-3超家族,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,刚果红染色后初步分析BS-DX4所产纤维素酶谱条带。