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脂肪细胞主要是由起源于中胚层的多能间充质干细胞逐渐分化或发育而来。由间充质干细胞发育为成熟脂肪细胞包含定型和分化两个过程,这两个过程受到高度协调而且复杂的网络调控。动物从胚胎发育持续到成年都存在脂肪形成的过程。近年来,研究报道锌指蛋白基因参与成脂分化的关键转录调节,不仅能够调节细胞的成脂定型,也能调节细胞的成脂分化和脂肪沉积。值得注意的是,与脂质代谢相关的锌指蛋白基因受miRNA调控,进而影响脂肪细胞分化的研究逐渐被报道。本课题组在前期的研究中,将猪原代脂肪来源的血管基质细胞体外诱导成脂分化,利用转录组测序及实时定量PCR技术筛选出1个保守的脂肪SV细胞成脂分化的差异表达基因Zfp217,通过RNAi技术初步确定了其在猪源脂肪SV细胞成脂分化过程中的作用。但其在细胞成脂定型和分化上的功能以及如何受miRNA调控而影响脂肪细胞的分化作用尚不清楚。主要研究结果如下:1.锌指蛋白Zfp217的生物信息学分析运用生物信息学技术分析了Zfp217的多级结构和序列特征,结果显示:在三个物种(hsa、mmu和ssc)中,Zfp217均含有8个锌指结构,且第6个和第7个锌指结构在三个物种中的序列相似性最高;利用同源建模方法构建了构象符合立体化学规则的Zfp217蛋白序列三维结构模型;Zfp217蛋白质理化性质分析表明其在三个物种中均为亲水性蛋白,热稳定性低且其氨基酸序列不稳定;分析Zfp217的跨膜结构域发现,只在鼠和猪中预测到跨膜结构域;转录后修饰显示:在人、鼠和猪中都预测到了O-Gal NAc蛋白质糖基化位点和磷酸化位点。利用NCBI数据库检索Zfp217在真核生物多个物种中的蛋白序列,构建同源进化树,分析各物种蛋白序列的锌指结构基序。结果显示:从系统进化树来看,哺乳动物纲是其中最大的一类,各个纲或目之间界限分明,相同的纲或目内物种的序列具有更好的同源性且高度保守。C2H2类锌指结构基序广泛地分布在各个物种的序列中,并且数目从5到8个不等,数目为8的物种占绝大多数。利用GEO数据库检索Zfp217功能获得或功能缺失条件下的芯片数据集,对检索的数据集利用R语言分析获得了4个基因与Zfp217表达水平的变化相一致,33个基因相反。对这些获得的差异表达基因进行功能富集分析,发现它们富集在具有较高的生物活性过程中,并且富集在肿瘤癌症相关的生物学过程上。利用GEO数据挖掘获得121个乳腺癌差异表达miRNA,其中19个预测到在人和鼠Zfp217的3’UTR存在结合位点。在严格的筛选条件下,共预测到164个保守的miRNA靶向作用Zfp217,进一步文献挖掘发现,其中102个miRNA与癌症相关,关联性最大的癌症是乳腺癌。此外,数据挖掘还显示Zfp217与肥胖和成脂分化标记基因高度相关。因此,推测Zfp217可能参与成脂分化过程,并受miRNA的调控。2.Zfp217的表达与功能研究利用QPCR或Western blot分析了Zfp217在C3H10T1/2细胞成脂分化过程、猪和鼠不同组织以及肥胖小鼠模型脂肪组织中的表达模式。结果显示:Zfp217在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中的上调表达与成脂分化核心转录因子基因Pparg2相一致。在内脏脂肪组织中,Zfp217与Pparg2的表达趋势相一致,并呈现出相似的显著性。Zfp217的表达与一些促进成脂分化的早期标志基因(Cebpb,KLF4,Ebf1和ZNF395)的表达模式相一致。克隆了鼠Zfp217基因编码区,探讨了在Zfp217功能获得或功能缺失情况下对细胞成脂分化的影响,结果显示:Zfp217功能获得或缺失与C3H10T1/2细胞成脂分化的脂滴形成以及甘油三酯含量呈正相关。利用QPCR、流式细胞术、哺乳动物双杂交等试验分析了Zfp217调控细胞成脂分化的机制,结果显示:Zfp217超表达能够显著抑制Wnt信号基因的m RNA水平。此外,细胞成脂诱导4 d时,成脂标记基因在Zfp217的不同处理组发生显著性改变。双杂交试验显示在鼠源背景下,Zfp217与Ezh2存在蛋白互作。表明Zfp217促进细胞成脂分化是通过抑制细胞DNA合成,影响细胞周期,并与Ezh2互作抑制Wnt信号基因的表达而实现的。3.靶向作用Zfp217的miRNA筛选、验证及功能研究利用多种生物信息学预测网站预测靶向作用Zfp217的miRNA:在人中共预测到176个,在鼠中共预测到213个,在人和鼠中共同出现的miRNA有42个。利用功能注释和进化分析进一步筛选出了5个候选miRNA:miR-503、miR-135a、miR-26a、miR-19a/b和miR-1a。利用双荧光素酶试验、QPCR和Western blot验证了miR-503、miR-135a和miR-19a可以通过靶向结合Zfp217 3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)降低Zfp217在细胞内的表达。分析了候选miRNA在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中、猪和鼠不同组织中以及肥胖小鼠模型五种脂肪组织中的表达模式。利用多种实验技术检测了miR-503和miR-135a对细胞增殖、细胞周期和细胞DNA合成的作用。结果表明:miR-503、miR-135a和miR-19a靶向作用Zfp217并抑制细胞的成脂分化过程。