论文部分内容阅读
在免疫系统发育过程中，及时有效地清除自身反应性T细胞和/或B细胞是维持自身免疫耐受的重要环节。BCR信号转导在B细胞发育、成熟、增殖及分化等过程中起重要作用。B细胞在未成熟阶段，因BCR受到自身抗原刺激而得到清除，发生自身免疫耐受；而成熟B细胞BCR与外来抗原结合，可启动针对外来抗原的免疫应答。
小鼠B淋巴瘤细胞WEHI231细胞膜Ig的聚集可诱导细胞生长阻滞在G1期并发生细胞凋亡，而T细胞或T细胞产物如CD40配体(CD40L)可阻断这一作用。因此wEHI231细胞已被广泛用于研究未成熟B细胞阴性选择信号转导以及B细胞自身耐受机制的典型细胞模型。
碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族以及作为bHLH负调节子的分化抑制因子(Id)在淋巴细胞的发育、分化、增殖和凋亡等过程中发挥重要调控作用。作为HLH家族成员的Id分子，本身缺乏DNA结合必需的碱性氨基酸序列，它与bHLH结合成异二聚体后可抑制bHLH与DNA或其他组织特异性bHLH转录因子结合，从而抑制细胞分化。近几年的研究表明，Id蛋白家族除了具备抑制分化、促进增殖这一功能外，还具有更广泛而复杂的生物学作用，根据细胞类型及其发育阶段的不同，Id蛋白可能发挥诱导凋亡的作用，也可能行使存活因子的功能。
本论文的主要研究内容包括：1.抗IgM抗体刺激WEHI231细胞上调Id3表达，CD40L共刺激可抑制此作用用抗IgM抗体或/和CD40L刺激WEHI231细胞，用Northernblot法分析表明，抗IgM刺激可诱导WEHI231细胞Id3mRNA表达上调，CD40L单独刺激或与抗IgM共刺激均可明显抑制Id3mRNA的表达。Westernblot研究结果与Northernblot结果一致。说明抗IgM可诱导Id3在mRNA和蛋白质水平的上调表达，而且这一作用可因CD40L的共刺激而得到缓解。
2.Id3过度表达导致细胞生长阻滞在G1期将小鼠Id3(mId3)cDNA插入逆转录病毒载体pMX-CITE/IRES-EGFP中，构建逆转录病毒pMX-Id3/EGFP和对照pMX-EGFP；感染WEHI231细胞后，用流式细胞术检测细胞EGFP表达情况。结果表明，pMX-EGFP逆转录病毒感染的细胞，感染5天后，EGFP阳性细胞比例基本保持不变；而pMX-Id3/EGFP逆转录病毒感染的细胞，EGFP阳性细胞比例随时间呈下降趋势。说明外源性Id3表达可抑制WEHI231细胞的生长。为研究Id3对细胞周期进程的影响，对pMX-EGFP和pMX-Id3/EGFP感染的细胞进行分选，选择EGFP阳性细胞进行PI染色分析，结果表明，pMX-Id3/EGFP转导细胞组G1期细胞比例比pMX-EGFP转导细胞组明显升高，说明Id3通过减少G1期细胞进入S期细胞的数量，抑制细胞的生长。
3.mId3基因5′端邻接区域启动子活性分析从WEHI231细胞基因组DNA扩增mId3基因5′端含启动子序列的DNA片段(mId3-pf)，从起始密码子上游+1bp开始，扩增片段长度分别为：-3k～+1bp(mId3-p3k)，-2k～+1bp(mId3-p2k)，-1k～+1bp(mId3-p1k)，和-260bp～+1bp(mId3-p260bp)；在此基础上产生mId3-p470bp缺失体。将上述DNA片段插入荧光素酶(Luc)报道基因载体pBV/B2，构建重组载体(mId3-pf/B2)，经电穿孔转染WEHI231、BAL17、J558L细胞，通过测定细胞裂解液中Luc活性，判断上述细胞内mId3启动子活性。结果表明，5种Luc报道基因载体转染细胞均表现较高的mId3启动子活性，未成熟B细胞(WEHI231)较分化细胞(J558L)的Id3启动子活性明显增高。260bp片段显示最高的启动子活性，提示此DNA区域(-260bp～+1bp)为mId3启动子的核心部位；260bp和470bp的启动子活性要高于1k2k和3k片段，提示在-1k～-3k的区域内可能存在转录负调控元件。
4.抗IgM刺激上调WEHI231细胞mId3启动子的活性用抗IgM抗体和/或CD40L刺激Luc重组载体转染的WEHI231细胞，胞内Luc活性测定结果表明，抗IgM抗体刺激可明显增强Id3启动子活性；而CD40L刺激细胞后，Id3启动子活性与未刺激细胞相比，无显著性差异。提示抗IgM诱导Id3的上调表达主要作用于Id3基因转录环节；而CD40L刺激信号下调Id3的表达可能通过其他调控环节。
5.泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解是CD40L诱导Id3下调表达的重要途径磷酸化位点突变型Id3基因瞬时表达细胞受到CD40L的刺激并不能改变CD40L缓解Id3诱导的细胞生长抑制的作用，表明Id35ser和105Thr的磷酸化可能不参与CD40L介导的缓解Id3诱导的细胞生长抑制功能。构建逆转录病毒pMX-FLAG-Id3-EGFP，并建立稳定表达FLAG-Id3融合蛋白的WEHI231细胞系(pMX-FLAG-Id3-EGFP/WEHI231)，上述细胞与CD40L/NIH3T3和NIH3T3细胞共同培养24h后，收集、裂解细胞，细胞上清进行Westernblot，用抗FLAGMcAb检测mId3融合蛋白表达量。结果显示，CD40L刺激可明显抑制pMX-FLAG-Id3-EGFP/WEHI231Id3蛋白的表达。pMX-FLAG-Id3-EGFP/WEHI231细胞与CD40L/NIH3T3和NIH3T3共培养前；用蛋白酶体抑制剂Lactacystin，MG-132，ALLN和ALLM预刺激细胞1h。Westernblot结果提示，上述蛋白酶体抑制剂在一定浓度范围内均可阻止CD40L诱导的Id3蛋白降解。细胞裂解液与交联了抗FLAGMcAb的蛋白G-agarose珠进行免疫沉淀，用抗泛素McAb及抗FLAGMcAb作Westernblot分析。结果表明，CD40L刺激后Id3泛素化水平要高于刺激前的水平，提示在CD40L诱导的Id3下调表达过程中，Id3受到泛素化修饰，进入蛋白酶体系统进行降解。
6.本研究的创新点本研究首次在小鼠未成熟B细胞WEHI231细胞中，观察BCR和CD40信号活化对Id3表达的调控及其分子机制。结果表明，抗IgM抗体刺激小鼠B淋巴瘤WEHI231细胞可诱导Id3mRNA和蛋白水平的上调表达；这一作用可因CD40L的协同刺激而得到缓解。Id3在WEHI231细胞中的外源性表达可将细胞周期阻滞在G1期，但并不诱导细胞凋亡。抗IgM诱导Id3的上调表达主要作用于Id3基因转录环节。CD40L可能通过下调Id3的表达而缓解Id3诱导的细胞生长抑制作用。蛋白酶体抑制剂(Lactacystin，MG-132，ALLN，ALLM)可阻断CD40L诱导的Id3的蛋白降解；CD40L刺激后Id3泛素化水平要高于刺激前的水平。本文首次提出，CD40L诱导的Id3表达下调主要通过蛋白的泛素化和蛋白酶体降解途径。
上述结果表明，分化抑制因子Id3参与未成熟B细胞的BCR/CD40信号转导途径，Id3的表达调控在抗IgM诱导的未成熟B细胞的生长抑制过程中发挥作用。为进一步探讨Id的生物学功能，以及BCR/CD40信号在介导未成熟B细胞的生长调控过程中的可能分子机制，提供了理论和实验依据。