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香蕉细菌性软腐病菌(DickeyazeaeMS3)为革兰氏阴性细菌,其寄主范围广、能同时侵染单、双子叶植物,在我国虽无频繁报道,但在病害流行地区会造成较大损失,目前已被列为302号检疫性有害生物,尤其近年来在广东香蕉产区大规模爆发,造成严重的经济损失。病原细菌与寄主细胞之间存在着广泛而复杂的信号交流,但这方面的研究刚刚开始。本项目以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS3为主要研究对象,研究病原菌多胺信号途径在病原—寄主互作过程中的作用,重点研究多胺对病原菌重要毒力相关基因,包括重要致病因子、运动性、生物膜形成和T3SS分泌系统的调控作用,同时,根据T3SS效应蛋白基因的表达情况,构建特异性多胺检测体系,揭示多胺信号应答线索和调控网络,阐明香蕉软腐菌的致病机理,从分子水平上认识病原-寄主互作机制,为发展新型病害防控策略建立理论基础。主要的研究结果如下:1、通过比对香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS1基因组序列,预测得到MS1中与多胺合成途径相关的基因4个,分别为speA、speC、spe D和speE,并查找到4套与多胺转运相关的ABC transporter proteins(共16个基因)和另外两个可特异性转运腐胺的内膜蛋白编码基因plaP和puuP。鉴于MS1和MS3菌株具有高度同源性,我们采用基因缺失突变的方法获得了除△speC和△puuP外的29个单敲除、双敲除及多敲除突变体。2、生物学测定和毒力因子表型分析结果表明,29个突变体在生长速率、细胞壁降解酶活性和生物膜形成上均与野生型MS3无明显差异;而大部分突变体的运动性、致病力较MS3均有不同程度的减弱,其中突变体△potC2、△spe A、△potF△spe A、△speA△plaP、△potF△plaP△speA的运动性和致病性减弱最为明显,游动性分别减少为野生型的76.7%、46.4%、31.9%、39.1%、24.9%,涌动性分别减少为野生型的81.7%、59.7%、45.3%、56.7%、34.2%,对马铃薯块茎的致病力分别减少了13.5%,19.2%、22.3%、14%和23.6%,△potC2、△speA△plaP接种的粉蕉苗发病数量比野生型减少11.1%,其余均减少22.2%。据此推断膜蛋白PotC2和腐胺合成过程中的关键酶精氨酸合成酶SpeA对香蕉软腐菌的运动性和致病性起着重要作用,且多胺合成途径中,腐胺参与了对香蕉软腐菌运动性和致病性的调控过程。3.对speA、potF、potC2、plaP基因进行互补,运动性测定结果表明在低浓度的外源腐胺诱导下△speA的运动性基本恢复到野生型水平,但△potF△plaP△spe A还可吸收外源腐胺,说明还存在另外的转运蛋白,对腐胺的转运起着关键作用。加入粉蕉组织液进行诱导后,野生型、突变体及互补体的致病力比接种未经诱导的菌体提高。这说明寄主产生的腐胺,可作为一种信号分子,进一步诱导和提高病原菌的致病力。运动性和致病性结果非常吻合,说明腐胺在致病过程中的作用可能是通过影响菌体的运动性,从而间接影响其对寄主的致病性。4、转录组数据表明,野生型MS3加入粉蕉苗组织液培养后共有701个基因表达差异明显,其中207个基因表达下调,494个基因上调。加入粉蕉苗组织液后编码精氨酸脱羧酶的speA基因表达量上调接近3倍,说明粉蕉苗组织液对腐胺的合成具有促进作用。另外腐胺运输所需的pot F基因表达稍有上调,与亚精胺转运相关的pot D1、pot D2、pot A1、pot A2、pot D1、pot D2、pot D3上调了2.05-8.84倍,说明粉蕉苗组织液含有的多胺信号物质对部分多胺转运相关基因也具有诱导作用。另外,用寄主组织液诱导培养后,MS3的整个T6SS系统基因表达下调非常明显,其中impB、impC、impG、impH、impI、impJ、impK、vasD、vasI、vasJ、impL、vasL、1349表达下调了2.6-8.7倍。已报道T6SS可介导细菌和真核生物之间的合作或竞争作用,对于T6SS在香蕉细菌性软腐病菌与寄主互作过程中发挥的作用,需要我们后期的研究;再者,寄主组织液诱导增强了细胞壁降解酶的活性,如7个果胶酶、2个纤维酶和1个蛋白酶编码基因的表达上调明显,同时,我们发现用组织液诱导香蕉软腐菌接种后,菌株的致病力都有所增强,推测细胞壁降解酶活性的增强是致病力增强的主要原因。5、为进一步明确腐胺是否对III型分泌系统具有诱导表达的作用,本研究用实时荧光定量的方法测定了9对T3SS效应蛋白基因的表达情况,实验结果表明,speA基因失效后病原菌合成腐胺及摄入外源多胺的过程受到抑制,T3SS效应蛋白基因未能显著诱导,但加入寄主组织液后,hrpA、hrpJ、hrpN、hrpP、hrcS、hrpX、q2066基因的表达量均有所上调,部分基因在MM培养基中的表达量可增强至野生型水平,说明病原细菌可以通过接收培养基或寄主体内的腐胺信号诱导而触发III型效应蛋白编码基因的表达。