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为了应对噬菌体的入侵,细菌进化出了CRISPR-Cas系统来抵御噬菌体。作为细菌的适应性免疫系统,CRISPR-Cas系统发挥免疫作用的过程可以分为三个阶段:spacer获取、cr RNA生成和DNA干扰。根据干扰阶段中效应分子数量的不同CRISPR-Cas系统可以分为class I和class Ⅱ两大类。Class I系统中干扰阶段需要多个效应蛋白参与,其中又细分为I、ⅡI和IV型。在class Ⅱ系统中,只有单个效应蛋白参与干扰阶段,包括Ⅱ、V和VI型。鉴于CRISPRCas系统能够特异性剪切双链DNA的特性,它被逐渐开发成了一种高效的基因编辑工具。其中Ⅱ型CRISPR-Cas系统中的化脓性链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9,Spy Cas9）应用最为广泛。但由于其分子量较大（150 k Da）,因此不易转染细胞从而影响了它的应用。因此,目前很多研究人员正在寻找可以替代Spy Cas9的更加袖珍的编辑蛋白。其中,同样属于Ⅱ型CRISPR-Cas系统中的金黄色葡萄球菌Cas9（Staphylococcus aureus Cas9,SauCas9）是很好的候选者之一,大约比Spy Cas9少300个氨基酸,同样具有较高的细胞内的编辑效率以及较低的脱靶效应。虽然CRISPR-Cas系统是一个非常强大的基因编辑工具,但是目前在实际应用中还存在很多问题,其中最重要的一个问题就是脱靶效应,这对它的应用带来了很多不确定的因素。因此,研究CRISPR-Cas系统的调控机制具有重要的意义。研究结果表明,面对细菌的这种进化压力,噬菌体也进化出了相对应的拮抗机制,其中发挥功能的主要蛋白被称为Anti-CRISPR蛋白（Acrs）。作为CRISPR-Cas系统的抑制蛋白,Acrs可以作为调控基因编辑的开关。AcrⅡA14被发现能够抑制SauCas9蛋白的活性,但是AcrⅡA14具体的抑制分子机制还不清楚。因此,研究AcrⅡA14的抑制机制有助于更好地利用SauCas9系统,同时也能扩展对Acrs抑制CRISPR-Cas系统机制的了解。在本课题的研究工作中,首先通过体外酶切实验、GST pull-down实验以及凝胶排阻层析实验证明了AcrⅡA14蛋白是通过直接与SauCas9蛋白相互作用来发挥抑制功能的,并且它的结合不影响SauCas9蛋白与sgRNA和dsDNA的结合。此外,通过实验数据表明,主要参与抑制功能的是它的C端结构域（AcrⅡA14ct）,N端的HTH结构域在抑制过程中是非必要的。在进一步的研究中,探究了AcrⅡA14对不同Cas9的抑制活性,发现AcrⅡA14对另外两种常用的Spy Cas9和Nme Cas9蛋白没有抑制效果。这说明了AcrⅡA14是一种SauCas9的特异性抑制蛋白。为了阐明AcrⅡA14特异性抑制SauCas9蛋白的分子机制,本文首先表达纯化了AcrⅡA14ct和SauCas9蛋白。然后,再体外组装得到了稳定的SauCas9-sgRNA-AcrⅡA14ct-dsDNA四元复合物蛋白。通过X射线晶体学的方法解析了SauCas9-sgRNA-AcrⅡA14ct-dsDNA复合物的结构,分辨率为2.22?。晶体结构显示AcrⅡA14ct蛋白以单体形式存在,由4个β折叠片和位于一侧的4个α螺旋组成。SauCas9核酸复合物结构呈现典型的二裂片的形式,sgRNA和底物DNA形成的核酸杂交链从裂片中间的通道穿过。AcrⅡA14ct与SauCas9以1:1的化学计量比相互作用,AcrⅡA14ct主要结合在SauCas9蛋白的HNH结构域上,同时也与L2 linker有部分的接触。具体来说,AcrⅡA14ct主要通过它的β2折叠片、C末端、α2与β4以及β4与α3之间的loop与SauCas9蛋白的HNH结构域上由α4和α5形成的凸起部分形成了广泛的相互作用。基于对结构的分析,进一步设计了突变体实验,证实了结构的正确性。根据结构和功能的实验数据,推测AcrⅡA14通过直接结合到SauCas9蛋白的HNH结构域上,从而对于HNH结构域向靶DNA序列靠近的激活过程产生了空间位阻,进而到达抑制激活的目的。通过进一步比较SauCas9-sgRNA-AcrⅡA14ct-dsDNA四元复合物与之前报道的SauCas9-sgRNA-dsDNA三元复合物的结构,发现AcrⅡA14ct与HNH结构域的结合引起了HNH结构域向核酸杂交链的靠近,同时又导致了HNH结构域与Ruv C结构域之间的L1 linker也发生了明显的变构。通过结构分析,发现这两个结构域的变构,导致形成了两个新的分子内的互作界面。HNH结构域上的氨基酸残基Arg617与L1 linker上的Lys485和Lys489残基分别与靶DNA链和sgRNA的核酸骨架形成了相互作用。通过结构信息设计的突变实验,证实了这三个残基的突变能够降低AcrⅡA14ct对SauCas9的抑制能力。以上实验数据表明,AcrⅡA14ct不仅能够通过直接与HNH结构域结合,从而阻止其向底物dsDNA靠近,起到抑制SauCas9激活的作用。同时也能通过诱导SauCas9蛋白的HNH结构域和L1 linker的变构,进一步增强AcrⅡA14的抑制能力。在之前的报道中已经发现AcrⅡC1和AcrⅡC3蛋白同样通过直接与HNH结构域结合来抑制Cas9蛋白的活性。通过结构数据的比较分析,发现AcrⅡA14与HNH结构域的结合区域明显不同于AcrⅡC1和AcrⅡC3蛋白。对SauCas9、Spy Cas9和Nme Cas9蛋白的HNH结构域进行多重序列比对,发现AcrⅡA14和AcrⅡC3结合的区域在这三种Cas9蛋白中是相当不保守的,而AcrⅡC1结合的区域是非常保守的,这也解释了AcrⅡA14对SauCas9抑制的特异性。此外,目前没有发现AcrⅡC1和AcrⅡC3蛋白与HNH结构域的结合也能引起类似于AcrⅡA14结合对Cas9蛋白的变构效应。在本研究论文中,首次解析了SauCas9-sgRNA-AcrⅡA14ct-dsDNA四元复合物2.22?分辨率的晶体结构。通过结构分析和生化实验,阐明了AcrⅡA14蛋白特异性抑制SauCas9酶切活性的分子机制。AcrⅡA14与SauCas9的结合方式和多机制的抑制手段与以往发现的Acrs蛋白是有所不同的。这个发现拓展了对Acrs抑制CRISPR-Cas系统的理解,对更好地利用CRISPR-Cas系统,尤其是SauCas9系统提供了理论基础。