论文部分内容阅读
目的：肢带型肌营养不良(limb girdle muscular dystrophy，LGMD)为一组高度遗传异质性疾病，临床上病变主要累及上、下肢带肌，或以肢带肌首先受累，逐渐出现全身肌肉的无力和萎缩。现在根据遗传学特点把这一组疾病分为常染色体显性肢带型肌营养不良(LGMD1)和常染色体隐性肢带型肌营养不良(LGMD2)两大类，根据受累基因的不同LGMD1分为LGMD1A～LGMD1G七种类型，LGMD2又分为LGMD2A～LGMD2L十二种类型(表格1，Neuromuscular Home Page of WU．url)。远端型肌病是另一组以四肢远端肌肉无力和萎缩为主要表现的原发性肌肉疾病，根据病理及遗传学特征，临床上亦有多种亚型，如：Nonaka型、Miyoshi型、Welander型及眼咽型远端型肌病等，各型受累肌群和病情发展亦有较大的异质性。Dysferlinopathy是由位于2p13的DYSF基因发生突变引起相应的基因产物dysferlin表达异常导致的肌营养不良性疾病，临床上可以表现为肢带型肌营养不良中的LGMD2B型，也可以表现为远端型肌病的Miyoshi型。本研究选取98例临床病理诊断为肌营养不良的病人，利用免疫学方法检测病人肌肉中dysferlin的表达，进一步探讨dysferlinopathy的临床和病理特点，借以与各型肌营养不良和炎症性肌病进行鉴别，并对我国dysferlinopathy的发病特点进行估计。材料和方法：选取山东大学齐鲁医院神经肌肉病研究室接诊的98例临床和病理诊断为肌营养不良病人的肌肉标本，其中Duchenne型肌营养不良(DMD)22例，Beker型肌营养不良(BMD)14例，肢带型肌营养不良(LGMD)56例，远端型肌营养不良(MM)6例。另选病理报告为正常的肌肉标本5例做为对照。经液氮预冷的异戊烷中速冻的冰冻肌肉标本制成4μm冰冻切片，用抗dystrophin C-terminal、dystrophin Rod、dystrophin N-terminal、α—sarcoglycan和dysferlin蛋白的五种单克隆抗体做免疫组织化学染色(IHC)，对dysferlin染色有缺陷病人的冰冻肌肉标本，提取肌组织总蛋白行dysferlin蛋白印迹分析(western blot，WB)。结果：IHC与WB分析结果：在98例肌营养不良病人肌肉组织中，经IHC共发现有dystrophin染色缺陷43例，dysferlin染色缺陷16例，α—sarcoglycan染色缺陷9例。其中dystrophin完全缺失20例，显色不完整或减弱23例，dysferlin完全缺失5例，显色不完整或减弱11例，α—sarcoglycan完全缺失3例，显色不完整或减弱6例。同时存在α—sarcoglycan和dystrophin缺陷5例，其中dystrophin缺失伴α—sarcoglycan减弱2例，α—sarcoglycan缺失伴dystrophin减弱1例，两种蛋白染色均缺失1例，均减弱1例，dysferlin染色减弱同时伴有α—sarcoglycan缺陷1例(表格2，表格3)。对16例IHC显示肌肉中dysferlin蛋白有缺陷病人的肌肉标本，提取肌肉组织总蛋白并测定提取液蛋白浓度后，进一步作WB分析，定量检测dysferlin。结果发现有5例病人肌肉中dysferlin完全缺失，与IHC结果一致，3例在15％以下(表格5)，根据ENMC标准，这8例病人诊断为原发性Dysferlinopathy，以上8例病人IHC显示α—sarcoglycan与dystrophin染色正常。其余8例IHC显示dysferlin有缺陷病人，WB结果在正常对照值的30％以上，认为不属于原发性dysferlinopathy。结论：1．本组8例dysferlinopathy，3例为近端型，去掉LGMD中免疫组化证实为BMD的12例病人，LGMD2B占全部LGMD的7％(3／44)，低于日本报告的18％。有MM型5例，占全部MM的83％(5／6)，提示我国的dysferlinopathy可能主要表现为远端型。2．本研究在对dysferlin的免疫学检测中运用了IHC和WB两种方法，以对IHC在dysferlinopathy诊断中的可靠性进行验证。结果发现在IHC表现为dysferlin完全缺失的5例病人，WB结果亦为阴性，两种方法具有高度的一致性。有部分病人在IHC结果为dysferlin表达减弱，而在WB结果中判断为正常，鉴于WB结果的可靠性，我们认为对于dysferlinopathy的诊断，首先行IHC进行筛检，不能肯定的病例应该进一步行WB分析，以获得可靠的诊断结果。3．BMD病人病情相对较轻，各个家系之间临床表现不尽相同，临床上很多地方与LGMD相互重叠，肌肉病理表现为不同程度的肌营养不良性改变，没有特异性，散发病例与LGMD做出鉴别，往往需要进一步的分子生物学检查。用免疫组织化学或免疫荧光方法标示肌纤维膜上的dysferlin和dystrophin，或者用WB方法证实骨骼肌组织dystrophin或dysferlin缺乏，是诊断与鉴别诊断两种肌病的有效方法。IHC与WB也是dysferlinopathy与其他类型LGMD或远端型肌病相鉴别的主要手段。4．Dysferlinopathy肌活检的病理中炎性细胞浸润出现的频率明显较其他类型肌营养不良高，本组8例dysferlinopathy中有3例出现炎性细胞浸润，约占37.5％，炎性细胞主要分布在肌间质及小血管周围。由于多发性肌炎的起病年龄和临床表现与本病非常相似，仅通过普通肌肉病理观察很容易将伴有炎性细胞浸润的dysferlinopathy误诊为多发性肌炎。两者鉴别主要依靠免疫组织化学或蛋白印迹方法对dysferlin表达进行分析。