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石斛属(Dendrobium Sw.)隶属兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendroideae),全属约1450种,是兰科最大的属之一,大部分类群为附生,主要分布于亚洲和大洋洲的热带和亚热带地区。该属植物具有极高的观赏、药用和经济价值,深受植物学家和植物爱好者青睐。但自从石斛属建立至今的二百多年来,其系统发育关系和高度物种多样性形成的机制一直不甚清楚。本研究利用核基因和多个叶绿体基因片段,重建石斛属的系统发育关系,并结合分子钟和生物地理分析探讨该属地理分布格局的形成过程,同时对该属交配系统进行祖先状态重建,探索其交配系统的演化式样。此外,本研究还利用铁皮石斛全基因组数据,探讨了NBS基因的进化与石斛属高度物种多样性形成及其对不同生境适应的关系。 1.石斛属的系统发育 本研究对广义石斛属217个种进行研究,利用核基因ITS和7个叶绿体基因片段,重建了石斛属的系统发育关系,解决了石斛属特别是亚洲分支内部的关系。结果表明,广义石斛属分为三大分支,即厚唇兰属分支、澳大利亚分支和亚洲分支。亚洲分支分成两支(AsiaⅠ和AsiaⅡ)。其中,AsiaⅠ由七个亚分支组成:1)AsiaⅠ-a,由section Stachyobium的种和Dendrobium capillipes组成,位于AsiaⅠ-a-g的最基部;2)AsiaⅠ-b,由sect.Formosa的种组成;3)AsiaⅠ-c,由sect.Densiflora的部分种组成;4)AsiaⅠ-d,由sect.Calcarifera和sect.Pedilonum的部分种以及sect.Platycaulon的种组成;5)AsiaⅠ-e,由D.jenkinsii和D.lindleyi组成;6)AsiaⅠ-f,由sect.Pedilonum和sect.Calcarifera的部分种以及sect.Oxyglossum和sect.Calyptrochilus的种组成;7)AsiaⅠ-g,由Aporum/ Crumenatacomplex的种组成。除去基部三个种,AsiaⅡ由三个亚分支组成:1)AsiaⅡ-a,由sect.Holochrysa和sect.Stuposum的部分种以及sect.Breviflora和sect.Stachyobium的各一个种组成,位于AsiaⅡ-a-c基部;2)AsiaⅡ-b,主要包括sect.Dendrobium的种;3)AsiaⅡ-c主要包括了sect.Dendrobium的种和D.senile。澳大利亚分支由五个亚分支组成:1)AustraliaⅠ,由sect.Grastidium的种组成;2) AustraliaⅡ,由金石斛属的种组成;3)AustraliaⅢ,由sect.Latouria、sect.Spatulata和sect.Phalaenanthe的种组成;4)AustraliaⅣ,由sect.Rhizobium和sect.Monophyllaea的种以及sect.Dendrocoryne的两个种组成;5)AustraliaⅤ,主要包括sect.Dendrocoryne的种。本研究支持sect.Stachyobium和sect.Grastidium是单源的组;sect.Formosa除D.senile外是单源的组;sect.Dendrobium、sect.Densiflora、sect.Pedilonum和sect.Calcarifera是多源的组;支持D.capillipes作为独立的一个组;建议将sect.Holochrysa和sect.Breviflora并入sect.Dendrobium。本研究初步确定了几个一直以来系统位置不确定的种的位置,包括D.capillies、D.trigonopus、D.senile、D.jenkinsii和D.lindleyi。分子钟的估算显示,石斛属与厚唇兰属分化的时间在始新世(42.75Mya),石斛属亚洲分支和澳大利亚分支的冠群时间分别在渐新世(28.79Mya)和中新世(21.36Mya)。结合地理分布区特征分析表明,石斛属植物的分化和多样化与渐新世之后的冰期和间冰期的交替以及板块运动密切相关,即与气候变化、高山隆起和隔离等外界环境有关。上述结果澄清了石斛属重要类群之间的系统发育关系,揭示了石斛属的起源与分化历史,对兰科和一些快速进化类群的分子系统学研究有启示作用。 最大简约法对石斛属的交配系统进行的祖先状态重建结果显示,石斛属的交配系统为自交亲和和自交不亲和共存,它们分别位于多个分支上,表明自交亲和和自交不亲和经过了多次进化。 2.铁皮石斛NBS基因的分析 铁皮石斛是石斛属重要的成员之一,本研究利用铁皮石斛全基因组数据,选取兰科另外两个已有全基因组数据的物种小兰屿蝴蝶兰和深圳拟兰作为对照,对其NBS类抗病基因进行识别,并进行系统进化分析。结果显示,铁皮石斛的NBS基因数目为140个,明显多于另外两个兰科物种小兰屿蝴蝶兰(65个)和深圳拟兰(14个),结合三个种所在属的物种数目以及三个种的分布区所处生境,我们推测,可能数量较大的抗病基因使石斛属具备更强的抵御病菌侵袭的能力,促使其适应不同的生境,形成了高度的物种多样性。系统进化分析表明,在三个兰科物种NBS基因形成的六个分支中,有两支是铁皮石斛所特有的;铁皮石斛的43个基因和小兰屿蝴蝶兰的24个基因在另一分支中进行了大量的扩增,这应该是两个物种分化之后各自发生了基因重复事件,很可能是基因组上的串联重复事件产生的。以上结果将为石斛属抗病性研究提供理论基础,为石斛属高度多样性形成的研究提供一个思路。 本文通过加大取样量和增加分子标记数目的方法对石斛属的系统发育关系进行了重建,理清了石斛属特别是亚洲分支内部各组之间的关系,并对铁皮石斛NBS基因进行分析,探讨了NBS基因的进化与石斛属高度物种多样性形成的关系。