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近年来,由于大量抗生素在人类医药业、畜牧养殖业的滥用导致了大量耐药细菌的出现,其携带的抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)受到人们普遍关注。由于水产养殖尤其是鱼类养殖环境中抗生素和重金属的使用没有得到有效监管,抗生素、重金属残留导致抗生素抗性基因(ARGs)和重金属抗性基因(HMRGs)广泛存在于养鱼水体中。 本论文通过改变抗生素和重金属组合及分段添加抗生素和重金属浓度方式,设计10个鲫鱼养殖的鱼缸(30cm×20cm×20cm),选择3种常见的抗生素(四环素,磺胺嘧啶,头孢噻肟钠)和2种重金属(Cu,Zn)添加到10个鱼缸中,包括5个单独抗生素和重金属添加的鱼缸(四环素、磺胺嘧啶、头孢噻肟钠、Cu、Zn),4个复合抗生素-重金属添加的鱼缸(四环素+磺胺嘧啶+头孢噻肟钠、四环素+磺胺嘧啶、四环素+磺胺嘧啶+Cu、四环素+磺胺嘧啶+Zn)以及不添加任何抗生素和重金属的鱼缸作为空白对照,整个实验周期为180天,包括12个阶段,每15天为一个阶段,探究ARGs和HMRGs在抗生素和重金属选择压力下的产生过程。采用PCR(聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction)对21种ARGs和2种HMRGs定性检测,根据PCR检测结果,对19种ARGs和2种HMRGs进一步采用实时荧光定量PCR进行定量分析,同时测定各个鱼缸中3种抗生素和2种重金属浓度。利用ANOVA(单因素方差分析)分析各个鱼缸中目标 ARGs丰度的变化。采用皮尔逊相关性分析软件探究环境胁迫因子与所产生的多种抗性基因之间的相关性。本研究中的目的基因包括19种ARG(tetA,tetB,tetC,tetD,tetE,tetG,tetM,tetO,tetQ,tetS,tetW,tetX,tetY,sul1,sul2,sul3,blaDHA,blaMOX,blaFOX),2种HMRG(copA,czcA),作为基因标准化衡量指标16S-rRNA以及与基因迁移有关的指示基因1类整合子基因(intI1)。 结果表明,添加的抗生素和重金属在水体中的残留率分别为0.03%-2.46%和9.25%-52.97%,在相同添加浓度下,重金属残留率比抗生素高。在整个实验过程中,tetA,tetC,sul1和sul2在相应鱼缸中处于主导抗性基因。四环素类抗性基因比磺胺类抗性基因及AmpC-β内酰胺酶类抗性基因对抗生素具有更高的敏感度,该类抗性基因更容易受其相应抗生素的诱导而产生。双重和三重抗生素胁迫诱导的鱼缸中ARG的总相对丰度是所有单一抗生素胁迫的鱼缸中总和的1.01-1.55倍,且三重抗生素比双重抗生素对ARGs的诱导效应更明显。头孢噻肟钠、Zn、Cu的引入对四环素+磺胺嘧啶体系中ARGs的丰度和多样性影响结果表明,头孢噻肟钠与四环素、磺胺嘧啶复合比Zn和Cu与其复合产生的四环素抗性基因丰度和多样性更显著。此外,多变量Peason相关性分析结果显示tetA,tetD,tetS和tetX的丰度与头孢噻肟钠实测浓度存在显著相关性(r=0.912-1.000,p<0.05或p<0.01),tetO,tetQ,tetW和sul3与水样中Cu、Zn的浓度存在显著相关性(r=0.882-0.992,p<0.05或p<0.01)。tetO、tetW、sul3和intI1之间的显著相关性(p<0.01或p<0.05)暗示了核糖体保护蛋白基因在鱼类养殖环境中存在潜在的ARGs传播风险。