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沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，可作为活载体携带原核表达质粒和真核表达质粒，并能有效呈递抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。减毒沙门菌是异源抗原的优良载体，具有良好的侵袭力，能很好地定位于免疫组织器官中，被广泛用于DNA疫苗新型细菌载体的研究。沙门氏菌自身具有纤溶酶原激活活性，这种活性与其侵染性有一定的关系。组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA）是血管内皮细胞分泌的、具有特异激活血栓纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶，能够特异地激活血栓纤维上结合的纤溶酶原转变成具有活性的纤溶酶，对于促纤溶活性引起体内弥漫性出血的风险性小。本研究利用减毒沙门氏菌细胞内侵袭特性和口服给药及肠壁吸收的优势，构建携带t-PA基因的重组减毒沙门氏菌，探讨减毒沙门氏菌作为活载体用于表达功能基因和预防心脑血管栓塞性疾病及其康复期治疗生物制剂的可行性。本实验根据人t-PA的编码序列设计3对引物，分别扩增t-PA目的基因片段，构建原核表达质粒pET28-tPA和PYA3494-tPA及真核表达质粒pcDNA3-tPA。将重组质粒pET28-tPA和pcDNA3-tPA分别经电转化导入减毒沙门氏菌ΔcrpSL1344，重组质粒PYA3493-tPA电转化减毒沙门氏菌ΔcrpΔasdSL1344，构建重组菌crpSL1344（pET28-tPA）、 crpSL1344（pcDNA3-tPA）和crp asdSL1344（PYA3493-tPA）。重组菌分别转染体外培养的BHK细胞，SDS-PAGE检测t-PA表达情况，ELISA检测表达水平，纤维蛋白平板溶圈法检测纤溶活性；在此基础上，重组菌分别感染昆明白小鼠，Sysmex CA-50血凝仪检测凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原（FIB）。实验结果显示，重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）、 ΔcrpSL1344（pET28-tPA）和ΔcrpSL1344（pcDNA3-tPA）在BHK细胞中均有66kDa的蛋白表达，SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证明表达的目的蛋白为t-PA；转染96h的表达量分别为197μg/L、118μg/L和135μg/L，转染重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）的细胞裂解液和转染表达质粒的细胞培养上清均有促进溶解纤维蛋白的活性，转染真核重组菌ΔcrpSL1344（pcDNA3-tPA）较原核重组菌ΔcrpSL1344（pET28-tPA）的蛋白活性高，且以重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）的活性最高。在凝血四项的检测中发现，4组实验组与对照组相比小鼠的PT、APTT、TT都有不同程度的延长；其中，转染重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）组小鼠PT、APTT、TT延长极显著（P<0.01），FIB的含量降低极显著（P<0.01）。研究表明，减毒沙门氏菌菌体具有促纤溶活性，携带t-PA原核和真核表达质粒的减毒沙门氏菌具有较强的促纤溶活性，真核细胞能够修饰原核载体表达的t-PA蛋白；携带PYA3493-tPA质粒的无抗性标记的asd宿主载体平衡致死系统，使t-PA基因稳定携带并高效表达。本实验为减毒沙门氏菌作为t-PA基因活载体和血栓性疾病的新型生物制剂的研究提供了新思路。