【摘 要】
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近年来,癌症已经成为严重威胁人类生命和健康的一类疾病,癌症的发病率和死亡率不断飙升。临床上常用的化学抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞也会产生影响。而提取自动植物、微生物以及海洋生物体内的天然抗癌药物相比于传统药物就具有了更大的优势,不仅可以减轻临床症状和提高患者生存质量,在放化疗配合、增效减毒方面也有很好的效果。抗癌肽就是这样一种天然抗癌药物,抗癌肽具有低毒高效、不易产生耐药性、广谱的活性
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近年来,癌症已经成为严重威胁人类生命和健康的一类疾病,癌症的发病率和死亡率不断飙升。临床上常用的化学抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞也会产生影响。而提取自动植物、微生物以及海洋生物体内的天然抗癌药物相比于传统药物就具有了更大的优势,不仅可以减轻临床症状和提高患者生存质量,在放化疗配合、增效减毒方面也有很好的效果。抗癌肽就是这样一种天然抗癌药物,抗癌肽具有低毒高效、不易产生耐药性、广谱的活性等特点。九香虫Aspongopus chinensis Dallas,1851是昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae的传统药用昆虫,现代医学证明其具有良好的抗癌功效。课题组前期研究证明其血淋巴对人胃癌、乳腺癌等细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用,并从中分离出抗癌活性肽CcPT1。但是其分离得率极低,严重影响了九香虫这一优良传统药用昆虫的进一步开发应用。本研究在此背景下开展了九香虫CcPT1基因的克隆,并构建了p GEX-4T1-CcPT1重组表达载体,在大肠杆菌中成功的完成了目的蛋白的表达,以期为未来九香虫抗癌肽的进一步开发奠定基础。本研究具体结果如下:（1）对九香虫的CcPT1蛋白及狼蛛PT1蛋白的生物信息学分析显示,二者的理化性质相似,均为稳定的疏水性蛋白,且不存在信号肽和跨膜区域。此外,九香虫CcPT1蛋白也具有与蜘蛛毒蛋白家族相同的保守结构序列:G-Xa-CA-Xb-KG-Xc-C-Xd-IHCC-Xe-L-Xf-C,说明九香虫CcPT1蛋白确与狼蛛PT1蛋白同源。（2）根据已知的氨基酸序列设计多条简并性引物,但RACE法未能成功扩增出目的基因CcPT1的全长片段。因此通过全基因合成方式合成了CcPT1基因和PT1基因,并分别构建了重组表达载体p GEX-4T1-CcPT1和p GEX-4T1-PT1。将构建成功的重组表达载体转化到E.coli Top10菌株中进行亚克隆。并且三种阳性克隆的鉴定方式:菌落PCR检测、双酶切检测、测序鉴定结果都证明了重组表达载体构建成功。（3）将鉴定正确的重组表达载体转化到了E.coli Rosetta（DE3）表达菌株中,在IPTG的诱导下成功实现了CcPT1蛋白和PT1蛋白的可溶性表达,并试验出CcPT1蛋白的最佳诱导条件为20℃、0.75 m M浓度的IPTG诱导12 h;PT1蛋白的最佳诱导条件为20℃、0.75 m M浓度的IPTG诱导10 h。最终通过亲和层析方法纯化后成功获得了带有融合标签的目的蛋白。
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