黄秋葵(Abelmoschus esculentus L.)是一种重要的经济作物,其未成熟荚果以及粉剂状种子均可食用,在全球各地广泛种植。最新研究发现,在其肉质的荚果以及种子中均含有有益健康的植物化学成分和酚类化合物。然而,黄秋葵植株对多种生物和非生物胁迫极为敏感,这极大影响了它的生长和产量,并造成巨大的经济损失。这些问题可以通过基因工程的方法得到解决,比常规育种技术更快速有效。但是,黄秋葵是最难以进行基因改造的作物之一,其主要原因是缺乏高效再生组织培养技术体系。因此,本研究旨在建立一种高效的黄秋葵离体再生体系,并研究了再生体系构建过程中氮浓度及光照强度对愈伤组织中花青素和其他次级抗氧化物积累的影响。本研究利用两个栽培品种的黄秋葵试材开展了三项不同的体外实验,通过研究绿豆荚黄秋葵’wufu’的多项参数来建立高效且可重复的组织培养体系;而通过研究红豆荚黄秋葵’Hongjiao’的多项参数来研究花青素在体外的合成;在组织培养过程中,酚类化合物从下胚轴、子叶和子叶节外植体的切割处分泌到培养基中,从而阻碍了愈伤组织的形成和培养。为了克服这种现象,尝试了在培养基中加入抗褐变剂如活性炭、柠檬酸、抗坏血酸和硝酸银,均可有效促进了胚性愈伤组织的形成和培养。1.以下胚轴和子叶为外植体,建立黄秋葵’wufu’体外再生体系本部分试验对黄秋葵再生体系建立过程中酚类物质分泌、愈伤组织诱导及其再生的影响因素进行了优化。在培养基中添加不同浓度的抑褐添加剂,如活性炭(AC)、柠檬酸(CA)或结合抗坏血酸(AA),探究其抑制下胚轴和子叶外植体酚类物质分泌的效果。添加200 mg’L-1活性炭和0.5 mg·L-1 2,4-D + 1.5 mg·L-1 BA的MS培养基可以最有效抑制下胚轴外植体分泌酚类物质,更有效地将诱导愈伤组织的形成,愈伤组织的诱导率达67.67%;另一方面,加入5mg·L-1柠檬酸,5 mg·L-1抗坏血酸和1.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1 BA组合的MS培养基可以最有效抑制子叶外植体分泌酚类物质,有效地诱导愈伤组织形成,愈伤组织的诱导率达30.00%。在培养基中添加2 mg·L-1 BAP和O.1 mg·L-1 IBA可以最有效的诱导芽再生。下胚轴仍然是愈伤组织形成和芽再生的最佳外植体,愈伤组织的诱导率和芽的再生率分别为67.67%和52.67%。在1/2MS培养基中添加200 mg·L-1活性炭和2 mg·L-1 IBA作为生根培养基,生根率达76.67%。在人工气候箱培养中,使用蛭石和沙子(3:1)的无菌基质培养,进行组培黄秋葵苗的驯化。以上结果为抑制黄秋葵再生体系建立过程中酚类物质的分泌提供了一个可行的解决方案,同时评价了植物生长调节剂在’Wufu’黄秋葵品种再生过程中的调控作用。2.使用子叶节作为外植体开发了芽再生的快速且可重复的方法。由于在含有硝酸银(AgN03)和Pluronic F-68的MS培养基上培养中添加不同浓度的植物生长调节剂BA、TDZ和α-NAA,叶节段的切端均迅速变成褐色,而无法建立再生体系,而无法研究不同抗褐变剂的作用。因此,本实验中,设置在MS基本培养基中仅添加不同浓度的活性炭(AC),抗坏血酸(AA)和AgN03,来研究上述抗褐变剂抑制黄秋葵酚类物质的分泌,从而抑制褐变。将15 mg·L-1抗坏血酸添加到不含植物生长调节剂(PGR)的MS培养基中,可以成功的抑制外植体向培养基中分泌酚类物质。研究发现,在培养基中添加硝酸银和Pluronic F-68可以有效的增加芽的形成数量,含有0.5 mg ·L-1 NAA + 1 mg·L-1 TDZ + 0.1%Pluronic F-68的芽分化培养基诱导出芽数最高(每个子叶节外植体平均出芽9 3个)。在含有1 mg·L-1 BA+0.1 m ·-GA3的培养基中得到了最长芽长度5.3cm。在1/2MS培养基中添加200 mg’L-1活性炭和1 mg·’-1 IBA,作为生根培养基效果最佳,生根率达82%。在25 ±2℃和70%相对湿度的植物生长箱内,将组培苗定植与装有含有无菌蛭石和沙子(3:1)营养钵进行驯化。此外,从种子萌发到再生植物形成仅需105。.3.优化红豆荚黄秋葵’Hongjiao’的愈伤组织培养,诱导花青素形成。在离体培养条件下,氮和光是植物化合物、生物量积累和次生代谢物生成的关键决定因素。本实验中分析了总氮浓度MS培养基和光照强度对’Hongjiao’葵花秋葵愈伤组织培养的生物量、花青素色素和生物活性抗氧化剂的影响。在40 μmolm-2 s-1光强度下,使用含有60 mM氮元素的MS培养基进行愈伤组织培养,可以获得最高愈伤组织生物量(3gFW)。相比之下,在80 μmol m-2s-1光强度下,使用含有40mM总氮的MS培养基培养愈伤组织,可以得到最高花青素总量(TA;7.3 CV/g FW)、最高总酚含量(TP;12.07 mg/100 g FW)、最高总黄酮含量(TF;2.47 ± 0.15 mg/100 g FW)。试验实验结果表明,花青素的累积、总酚含量、黄酮类含量和抗氧化活性之间成正相关。用高效液相色谱(HPLC)对愈伤组织培养物进行定性定量分析,结果表明,大部分来自愈伤组织提取物的色素与荚果花青素相同,其在ODS-高效液相色谱柱上的保留时间短于荚果组织的主要色素。这些发现表明红荚黄秋葵的愈伤组织培养物可能是有工业应用价值的抗氧化生物活性化合物的潜在来源。4.综上所述,本研究解决黄秋葵再生体系的愈伤组织培养过程中褐化的问题,诱导花青素的大量形成,建立了黄秋葵高校再生技术体系。培养基中抗褐变剂的添加有利于降低外植体酚类化合物向培养基中分泌,并且改善了培养物的生长。此外,在黄秋葵组织培养过程中,植物生长调节剂的使用应该考虑到抗褐变剂和外植体的类型。MS基本培养基中抗褐变剂的添加显著改变了培养基组分配比,从而影响了外植体的反应。因此,培养基中植物生长调节剂的添加剂和操作的优化在组织和器官培养中是最重要的。本研究还证明了 MS培养基的总氮浓度和光照强度是影响愈伤组织中花青素积累的重要因素。最小的总氮浓度结合适宜的光照强度处理,可以提高抗氧化剂次生代谢物的生成。在红荚秋葵’Hongjiao’愈伤组织培养中,花青素和其他抗氧化化合物的积累可以通过包括诱导剂的方法来提高。总之,为了克服秋葵组织培养中的酚类化合物向培养基中的分泌、外植体褐变和培养失败问题,外植体首先应该在含有抗褐变剂培养基中进行初始培养,然后转移到不含抗褐变剂的培养基中。通过进一步的调查,本实验结果对棉花、茶叶、大白菜、花生和油菜等同样难以建立再生体系具有重要的参考意义,以便于这些植物的组培大量繁殖和分子育种。本研究中黄秋葵外植体培养于缺氮的MS培养基及适宜的光照强度可以提高愈伤组织中花青素含量和抗氧化能力。本研究建立的再生体系适用于黄秋葵快速大量繁殖和基因遗传转化。诱导愈伤组织产生大量花青素,为使用秋葵生产有益健康的次级代谢产物打开了的新视角。