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萜类化合物是广泛分布于生物界的一类天然产物,也是重要的生命物质。目前已经发现了两条萜类化合物的生物合成途径,即经典的甲羟戊酸途径和新发现的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。由于MEP途径只存在于人类的致病菌中而没有在人体中发现,这使得MEP途径中的关键酶成为了筛选抗菌素的新靶标。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是MEP生物合成途径中的第一个关键酶,目前普遍认为该酶仅能利用D-甘油醛-3-磷酸(D-GAP)为其天然底物,在焦磷酸硫胺素及丙酮酸的存在下合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP),而D-GAP的同分异构体磷酸二羟丙酮(DHAP)只有在被磷酸丙糖异构酶(TPI)异构化为D-GAP后才能被DXS利用来形成DXP。我们在用大肠杆菌DXS (EcDXS)酶法合成DXP时发现,DHAP同样也是EcDXS的直接底物,即它也可直接为EcDXS所利用来合成DXP,无需TPI的帮助。进一步的研究发现,EcDXS同时也可以在二价金属离子存在下催化D-GAP及DHAP这两个磷酸丙糖之间的相互转化。为了确证这一实验结果,我们选用大肠杆菌的tpi基因敲除菌株FB21547(DE3)为宿主重新制备了EcDXS,彻底排除了纯化后的蛋白中混有TPI的可能性,完全证实了EcDXS的磷酸丙糖异构化活性。本文还测定了EcDXS催化磷酸丙糖异构时的稳态动力学参数,以及反应pH、反应温度、金属离子对其磷酸丙糖异构化活性的影响。测定结果表明,EcDXS在催化磷酸丙糖异构化时Km D-GAP和Km DHAP分别为1.48mM、6.31mM,在pH7.0-8.5和反应温度30-40℃的范围内,该酶的磷酸丙糖异构化活性达到最高,并且该酶在催化磷酸丙糖异构时必须有二价金属离子(如Mg2+)的协助。同时,我们还采用1H-NMR跟踪了EcDXS催化磷酸丙糖异构化的过程,初步分析了EcDXS催化磷酸丙糖异构化时的反应机制。此外,本文的研究发现荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus) DXS和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DXS同样具有催化磷酸丙糖异构化的活性,进而确证了很多物种的DXS都具有催化磷酸丙糖异构化的功能。由于DHAP和D-GAP这两个天然的磷酸丙糖在生物体内参与了许多代谢途径,如糖酵解途径、糖异生过程、戊糖磷酸途径等,因此DXS可能在连接MEP途径与糖代谢中发挥着重要的作用。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR)是MEP途径关键酶中最有前景的抗菌素筛选靶标。该酶在二价金属离子和NADPH的辅助下催化DXP向MEP的转化。关于DXR的催化作用机制曾有两种假设,最终retro-aldol/aldol机制被认可,但此机制的一些细节问题仍需阐明。18O同位素交换实验是研究酶催化机制的有效手段之一。本文制备了18O标记的MEP,通过ESI-MS和NMR技术检测MEP中18O的标记位置及其丰度,深入分析了DXR催化DXP向MEP转化时的详细过程。在此基础上,我们证实了底物DXP与DXR酶-金属离子的C3-C4结合模式,并以此结合模式为基础,同时结合他人前期的研究结果提出了DXR的催化循环模型。按照底物DXP与DXR酶-金属离子的C3-C4结合模式以及该酶的催化循环模型,我们可以在retro-aldol/aldol催化机制的框架内合理地解释DXR酶促反应的各个细节。此外,借鉴DXP与DXR酶-金属离子的C3-C4结合模式,我们还对同样以retro-aldol/aldol机制介导反应的L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶进行了分析,详细探讨了此酶在催化过程中底物L-核酮糖-5-磷酸与酶-金属离子的结合模式。本论文的研究结果有助于全面了解DXS和DXR的催化机制,为以这两个酶为靶标进行新型抗菌素的筛选提供了合理的依据。