研究背景：糖尿病(diabetes Mellitus, DM)已成为世界上发病率最高、对人类健康威胁最严重的疾病之一。糖尿病所引起的糖代谢紊乱,导致微血管病变,以及高血糖本身对组织细胞的毒害作用,继而引起一系列并发症,包括糖尿病阳痿、糖尿病心肌病和糖尿病性痴呆等。对于糖尿病阳痿,有资料表明,大约一半患者在诊断为糖尿病10年后有可能合并勃起功能障碍(erectile disfunction, ED),其中约有12%的糖尿病患者ED是其首发表现。高血糖本身对心肌亦有毒害作用,流行病学研究发现,糖尿病患者70%以上死于心血管系统疾病,其中,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是糖尿病患者的主要并发症之一,其发病率高,危害性大,与糖尿病患者心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关。现已公认,糖尿病心肌病是一个独立的原发病,其发病不依赖于高血压、冠状动脉疾病和其他已知心脏疾病。此外糖尿病与认知障碍和痴呆亦有密切相关性：如在欧洲,糖尿病发病率在年龄大于65的痴呆患者中是6.4%。Leibson等报道了1455例成年发病的糖尿病病人中981人经一年观察后,101人产生了痴呆,其中77例为老年性痴呆。糖尿病上述多器官损伤的机制尚未完全明确,目前认为非酶性糖基化终末产物形成、蛋白激酶C信号通路的激活、氧化应激反应和己糖胺通路活性增高等具有重要作用。随着研究的深入,我们发现上述糖尿病上述脏器损伤均存在间质纤维化、相关细胞凋亡或突触可塑性改变等病理变化,因此高血糖状态下TSP-1和TGF-β1表达的改变和上述糖尿病患者多脏器损伤之间的关系引起了我们关注。血小板反应素(Thrombospondin, TSP),尤其是TSP-1,是重要的生理激活物之一作为一种大分子的细胞外糖蛋白,最初是在被凝血酶刺激的血小板a颗粒释放的产物中被发现,最新研究证实TSP并非血小板特有,可被肾小球系膜细胞、成纤维细胞等多种细胞分泌,许多组织如肾脏、心脏、软骨和脑中都有TSP基因产物的表达,是许多不同组织细胞外间质的重要成分。研究发现TSP-1由3条相同肽链构成的同源三聚体基质糖蛋白,每条肽链由N端、C端球状结构域、原胶原同源区、type1重复序列、type2重复序列、type3重复序列组成。其中type1重复序列(thrombospondin typel repeats,TSRs)由3个备解素样基序(TSR1、TSR2、TSR3)组成。转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一个分泌型的多肽信号分子超家族,在哺乳动物组织中存在3种形式的TGF-β,分别是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β1所占比例最高,活性最强。激活的TGF-β可使组织纤维化,引起纤维母细胞迁移,抑制胶原酶和其它金属蛋白酶的活性,增加胶原产生,降低胶原降解,促进基质沉积。研究表明,TSP-1分子KRFK序列可与L-TGF-β1的LAP区域结合,从而改变LAP的空间构型,使TGF-β1上与受体结合的位点暴露,成为活化的TSP-1/L-TGF-β1。同时新近研究发现海马区的血小板反应素与突触的建立活化和形态功能可塑性改变均有密切关系。因此,我们提出如下假设：糖尿病状态(如高糖等刺激)条件下引起体内各类细胞TSP-1和TGF-β1表达的改变,从而促进上述细胞纤维和胶原增生,最后导致纤维化,进而引起糖尿病勃起功能障碍、糖尿病心肌病,此外TSP-1表达改变在海马区亦可引起突触可塑性的改变,因此上述通路改变亦可引起糖尿病学习记忆能力的下降。研究已经表明,在哺乳动物中小干扰RNA(siRNA)能通过对生物学上保守结构的RNA进行干扰,从而抑制相应靶基因的表达。RNA干扰具有高度的序列特异性,能使靶蛋白的表达关闭。许多研究已经证实RNA干扰能阻断多种类型哺乳动物病毒的复制,抑制癌肿的生长。RNA干扰已经被开发成为反向遗传学的一个强有力的工具,并且已显示出广阔的治疗学上的应用前景。因此,我们有理由假设针对性开发TSP-1的小干扰RNA无疑对高血糖状态下神经元的损伤有一定的保护作用。我们通过研究高血糖状态下对海马区神经元TSP-1和TGF-β1的表达改变,同时设计siRNA对TSP-1的表达进行了基因沉默,并评估TSP-1表达下调对神经元的形态及突触形成的影响。期望能靶向干扰TSP-1表达,为糖尿病学习记忆能力下降的基因治疗提供一定的体外实验依据。第一部分TSP-1和TGF-β1在糖尿病大鼠阴茎、心肌和海马区表达改变的研究1目的研究TSP-1和TGF-β1蛋白和mRNA在糖尿病大鼠阴茎、心肌和海马区表达的改变情况,初步阐明TSP-1和TGF-β1通路参与了糖尿病大鼠高血糖状态下的上述脏器损伤。2材料与方法2.1糖尿病大鼠模型的制备SD大鼠随机分为糖尿病组和正常对照组,其中糖尿病组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)65mg/kg制成糖尿病模型,定期测尿糖、血糖及体重,以确保维持高血糖状态。正常对照组腹腔注射等量生理盐水,其余条件同上,喂养6周。2.2各脏器功能检测2.2.1行为学检测成模6周后各组大鼠分别进行Morris水迷宫实验(观察指标为逃避潜伏期和搜索策略),以检测糖尿病动物的学习、记忆能力的变化。2.2.2阴茎勃起功能检测成模6周后各组大鼠采用颈部皮下注射盐酸阿朴吗啡(APO)溶液(150ug/kg),剂量约1ml,持续观察30min,对其阴茎勃起情况进行检测。2.2.3心功能检测成模6周后各组大鼠充分麻醉后处死开胸,迅速取出心脏,置于4℃K-H液中除去血液,然后迅速转移并固定于Langendorff:灌流装置上,用改良K-H液行常规逆行恒压灌注(76mmHg),观察平衡灌注末的心脏作功量(rate-pressure product, RPP),即心率*左室发展压(HR*LVDP)的变化。2.3各脏器组织的病理变化观察成模6周后各组大鼠麻醉处死,分别取阴茎组织、心脏和脑,制作石蜡切片HE染色观察其病理改变,同时取心脏和海马区组织块制作电镜包埋和切片,电镜下观察其超微结构的变化。2.4免疫组化和实时荧光定量PCR法检测TSP-1和TGF-β1的表达成模6周后各组大鼠麻醉处死,分别取阴茎组织、心脏和脑,制作石蜡切片采用免疫组化ABC法观察上述各组织TSP-1和TGF-β1蛋白的表达,同时Trizol试剂盒提取细胞总RNA,随后逆转录合成cDNA,rt-qPCR法检测TSP-1和TGF-β1的基因转录情况。2.5统计学分析所有数值以均数±标准差(mean±D)表示,多组之间采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析,两组间比较采用t检验。3结果3.1体重、血糖和尿糖检测结果各组大鼠成模前,其体重、血糖和尿糖检测结果两组间无显著性差异,成模6周后,糖尿病组体重251.6±27.4g,血糖基本维持在19.8±2.8mmol/L,尿糖为++~+++。正常组大鼠体重397.4±21.3g,血糖为5.1±0.5mmol/L,尿糖阴性。两组差异有显著性意义(P<0.01)。3.2各脏器功能行为学Morris水迷宫实验显示,正常组大鼠第1天的逃避潜伏期为(40.1±26.0)s；第2天为(24.8±14.2)s；第3天为(13.4±4.8)s；穿台次数为(6.1±3.8)；糖尿病组大鼠第1天的逃避潜伏期为(71.6±33.7)s；第2天为(43.4±13.8)s；第3天为(26.9±19.1)s,穿台次数为(3.2±1.3),上述差异有显著性意义(P<0.01)。检测其阴茎勃起功能发现糖尿病组大鼠单位时间勃起次数和勃起率(1.4±O.5次/30min和40%)明显低于正常对照组大鼠(2.4±0.8次/30min和100%)(P<0.01)。心功能检测显示糖尿病组大鼠RPP值明显低于正常组大鼠,(P<0.01)。3.3各脏器病理改变各脏器组织HE染色观察发现,糖尿病组大鼠阴茎白膜厚度的增加,阴茎胶原纤维破坏,失去了其特有的起伏的外观,同时内皮和平滑肌细胞也退化及间质细胞增殖。糖尿病大鼠心肌细胞有不同程度的间质纤维化和心肌肥厚,心肌纤维出现了结构性的稀疏。电镜下可见糖尿病大鼠心肌微结构出现破坏,心肌细胞肌原纤维片状坏死、溶解,肌小节失去正常结构,甚至出现心肌细胞凋亡或坏死等现象。糖尿病大鼠海马区电镜观察可见神经元内部线粒体嵴消失,神经元之间突触结构蜕变,同时海马区单位面积突触数目明显少于正常组大鼠。3.4免疫组化和rt-PCR检测结果免疫组化检测发现,糖尿病大鼠各组织中TSP-1和TGF-β1的蛋白表达较正常对照组均明显上调,其中糖尿病组大鼠阴茎、心脏和海马区TSP-l和TGF-β1的单位面积阳性细胞数量均明显高于正常对照组(P<0.05),同时和实时荧光定量PCR法结果显示TSP-1和TGF-βmRNA表达较正常对照组亦明显上调(分别是对照组的2.8folds,1.7folds,6.6folds和6.9folds,4.3folds,1.42folds).4结论STZ诱导的糖尿病大鼠出现血糖增高、尿糖强阳性、体重增加不明显等一般情况改变,而且大鼠勃起功能、心功能和学习记忆能力均不同程度下降,同时伴阴茎、心脏和海马区不同程度的病理改变,此外糖尿病大鼠各组织中TSP-1和TGF-β1的蛋白和：mRNA表达较正常对照组大鼠亦明显上调。第二部分siRNA靶向干扰TSP-1对高血糖培养神经元形态和TSP-1表达改变的影响1目的明确siRNA靶向干扰TSP-1可有效改善高血糖状态下神经元形态改变和TSP-1/TGF-β1的表达,以及保护神经元形态和突触连接。2材料与方法：2.1细胞培养取孕16天SD大鼠,0.5%戊巴比妥钠麻醉,打开子宫,取出胎鼠,取大脑并分离海马。研磨组织并通过200目的滤网,收集细胞悬液,离心、重悬。接种于1×Polylysine包被的6孔培养板以及有小圆玻片的48孔培养板中,于37℃、5%CO2培养箱中培养,随机分为正常培养组、高糖培养组、高糖培养+转染组、高糖培养+阴行转染组、高糖培养+空白转染组。2.2siRNA制备与转染各对siRNA序列如下TSP-1sence5’-UACACUUGGCACCAGCAAAGCAGGG-3’, LacZ引物序列上游引物5’-ACCAGAAGCGGRGCCGGAAA-3’下游引物5’-CCACAGCGGATGGTTCGGAT-3’,上述siRNA由英維捷基(上海)贸易有限公司合成。上述细胞准备后,进行转染,而后轻轻振荡混匀,5%二氧化碳、37℃湿化空气中常规培养48小时。2.3扫描电镜观察上述细胞培养48小时后,吸干铺有小圆玻片48孔培养板中的培养液,4℃生理盐水洗1次,2.5%戊二醛固定1h,0.01M PBS洗2次,每次15min,1%锇酸固定1h,0.1M PBS溶液漂洗2次,每次15分钟。梯度酒精脱水,100%丙酮脱水20min。用50%醋酸异戊酯置换15min,100%醋酸异戊酯置换15min,临界点干燥,粘台,镀金,上机观察。2.4免疫组化检测及Western Blot检测上述细胞培养48小时后,0.01MPBS含0.3%的TRITON X-100(pH值7.4,PBST)分别洗净,然后沉浸含2%正常山羊血清的PBS2小时,TSP-1或TGF-β1抗体(1:100)和含有1%的牛血清白蛋白的PBS中4℃过夜,PBS(3×5min)洗净,生物素标记的羊抗兔IgG(1:200)孵育4h,PBS(3×5min)洗净,免疫标记diaminobenzdine0.05%,加0.3%H202的PBS,染色,镜下控制反应时间,然后用乙醇和二甲苯梯度脱水。其中PBS被用来代替一抗作为阴性对照。等量提取的蛋白装载到SDS/PAGE胶上并被分离后,再转移到PVDF膜上,然后用含有5%脱脂奶粉的TBST液封闭1小时,再分别用TSP-1或TGF-β1抗体(1:100)在常温下孵育,膜用TBST液洗涤4次,然后用抗鼠IgG-HRP(DAKO)在常温下孵育1小时,最后蛋白用ECL体系进行检测。蛋白相对表达量=待测蛋白的光密度值／内参的光密度值。2.5统计学分析所有数值以均数士标准差(mean±SD)表示,多组之间采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析,两组间比较采用t检验。3结果3.1扫描电镜观察各组培养细胞扫描电镜可见,正常组神经元表面细胞微绒毛结构完整,神经元间联系广泛而紧密,高糖培养组神经元细胞表面微绒毛结构缺失,伴脱落,细胞膜可见轻微破损,神经元间联系稀疏,而RNA转染组神经元上述病变较轻,同时阴性转染组神经元显示和高糖培养组程度类似的损伤。3.2免疫组化检测及Western Blot检测结果通过检测神经元TSP-1和TGF-β1蛋白表达来评估TSP-1siRNA对神经元上述蛋白表达的影响,结果发现TSP-1siRNA转染组TSP-1和TGF-β1蛋白的表达与高糖培养组相比显著地减少(P<0.01)。4结论通过siRNA靶向干扰TSP-1能有效改善高血糖状态下神经元形态改变和TSP-1和TGF-β1蛋白的表达,同时保护神经元之间的连接和形态。