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研究目的膀胱癌属于人体全身十大最常见肿瘤。2012年全球新增膀胱癌病例43万,死亡病例16.5万。2012年我国肿瘤登记地区膀胱癌发病率为6.61/10万,位列我国恶性肿瘤发病率第9位,居我国泌尿系统恶性肿瘤发病第一位。临床膀胱癌治疗方法的选择取决于肿瘤侵润膀胱壁的程度。电切术、全膀胱切除术治疗或膀胱部分切除术后,患者预后不佳,复发率极高。目前,基于顺铂的联合化疗方案(M-VAC方案)和顺铂方案(GC方案)已成为可以耐受顺铂的膀胱癌患者的标准治疗方案,但却无法回避化疗药物的毒副作用。而根据肿瘤标记物及其所在通路对膀胱癌患者进行靶向治疗,不仅不会波及肿瘤周围的正常组织细胞能有效杀伤癌细胞,可减少副作用,而且可提高患者耐受性，有很大临床应用前景。而包括西妥昔单抗、贝伐珠单抗等在内的膀胱癌靶向药物在临床研究阶段并未表现出明显的治疗效果。故针对膀胱癌的靶向药物的开发和试验成为目前亟待解决的问题。作为常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2(Euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2, EHMT2)的抑制剂,BIX-01294已被报道可以抑制膀胱癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌细胞的生长。我们通过前期药物筛选实验发现,BIX-01294能够明显抑制人类膀胱癌细胞的增殖。然而,BIX-01294诱导人类膀胱癌细胞凋亡的具体机制还尚无报道。本课题旨在阐明在BIX-01294诱导膀胱癌细胞凋亡的分子机制。研究方法1.磺酰罗丹明B (SRB)比色法检测BIX-01294对人膀胱癌细胞存活率的影响。2.免疫印迹法(Western Blot)检测BIX-01294处理后人膀胱癌细胞凋亡相关蛋白水平变化。3. 流式细胞术检测BIX-01294诱导人膀胱癌细胞凋亡的改变。4. siRNA干扰技术和外源表达研究EHMT2、PMAIP1、MCL1、USP9X、 DDIT3、TNFRSFIOA等基因在BIX-01294诱导人膀胱癌细胞凋亡过程中的作用。研究结果1.BIX-01294抑制T24和5637这两种人膀胱癌细胞的存活,并呈剂量依赖性。并且BIX-01294能激活凋亡蛋白酶CASP级联反应,具有剂量和时间依赖效应；且在敲低EHMT2后增强了BIX-01294诱导的CASP级联反应。2. BIX-01294上调T24和5637细胞中PMAIP1的表达,同时能够下调MCL1的表达,具有剂量和时间依赖效应。在T24和5637细胞中敲低PMAIP1和过表达MCL1均能够拯救BIX-01294引起的凋亡。3.BIX-01294下调T24和5637细胞中USP9X的表达,具有剂量和时间依赖效应。敲低USP9X可以下调MCL1同时增强BIX-01294诱导凋亡的作用。4.BIX-01294上调T24和5637细胞中DDIT3的表达,具有剂量和时间依赖效应。敲低DDIT3可以拯救BIX-01294诱导的凋亡。5. BIX-01294在T24和5637细胞中上调内质网应激反应相关蛋白HSPA5、ERN1和ATF4,并具有剂量和时间依赖效应。6.在T24和5637细胞中敲低CASP8能够削弱BIX-01294诱导的细胞凋亡。BIX-01294上调T24和5637细胞中TNFRSF10A的表达,具有剂量和时间依赖效应。敲低TNFRSF10A可以削弱BIX-01294诱导的细胞凋亡。7.在T24和5637细胞中敲低DDIT3使BIX-01294引起的TNFRSF10A表达上调的程度减弱。结论1.BIX-01294能够诱导人膀胱癌细胞凋亡,并与其抑制EHMT2的功能有关。2. BIX-01294诱导人膀胱癌细胞中的内质网应激反应。3. BIX-01294通过内质网应激反应,激活PMAIP1-USP9X-MCL1通路,引发膀胱癌细胞内源途径凋亡。4. BIX-01294通过内质网应激反应,上调TNFRSFIOA,从而引起人膀胱癌细胞外源途径凋亡。综上所述,我们发现BIX-01294能诱导人膀胱癌细胞凋亡。BIX-01294诱导细胞凋亡的分子机制。BIX-01294作为EHMT2特异性抑制剂,通过激活内质网应激反应,上调DDIT3的表达,进而通过PMAIP1-USP9X-MCL1内源途径和上调死亡受体TNFRSF10A激活外源途径诱导细胞凋亡。