研究酶稳定性机制，并建立有效的酶稳定化策略，不仅是生物学和蛋白质工程中具有挑战性的工作，同时也是工业生产中迫切需要解决的问题。科学家们期望通过对酶热力学和动力学稳定性的研究，揭示酶稳定性机理；生物产业更偏重于增强酶的动力学稳定性以提升酶在生产中的应用效率。大量研究表明，影响酶稳定性的因素很多，但就如何提升酶稳定性尚无统一规律可循。近年来，随着生物信息学及结构生物学的发展，科学家又提出以选择分子表面高柔性残基（具有较大B因子的残基）进行改造来提高酶稳定性的蛋白质工程策略，但该方法对提升分子量较大，结构较复杂的酶稳定性，尤其是动力学稳定性时存在一定的局限性。发展新的蛋白质工程策略，提高酶生物学稳定性，尤其是动力学稳定性，是扩展酶应用的有效途径。脂肪酶作为高效、高立体及区域特异性，环境友好的生物催化剂，能够催化酯水解、酯合成及转酯反应，在生物材料、医药、能源等工业中具有重要应用潜力。本论文以来源于南极假丝酵母的脂肪酶B（Candidaantarctica lipase B, CalB）为研究对象，通过对稳定因子的系统分析，探索―酶活性中心稳定化‖的蛋白质工程策略，在保持酶活性的基础上提升酶动力学稳定性，以期揭示酶活性中心区域稳定化对酶动力学稳定性的影响，发展有效的酶稳定化新途径。本论文主要开展了以下研究：（1）酶活性中心及表面区域残基突变对酶动力学稳定性的影响。我们将脂肪酶分子划分为两个不同的区域：活性中心区域和表面区域。首先，我们选取催化Ser105位点10以内的氨基酸残基作为酶活性中心区域，并对其B因子大小进行排序，选择高B因子残基作为靶标位点（F71，D223，L277，L278，A281，I285）。针对上述位点，我们分别构建了库容量为200的饱和突变库，并在相同的热失活温度下（55°C，15min）进行筛选，在保持酶活性的基础上，得到稳定性明显提高的突变体D223G和L278M。CalB野生型在48°C下的半衰期仅为3.8min，而突变体D223G和L278M在48°C下的半衰期相较野生型分别提高了3倍和6倍；我们以突变体L278M基因作为模板，进行下一轮的迭代饱和突变，最优突变体D223G/L278M在48°C下的半衰期为49min，为野生型的13倍，孵育15min的半失活温度（T5015）为58.5°C，较野生型提高12°C。对其进一步的稳定性表征发现，在显著提升酶动力学稳定性的同时，对热解折叠及化学变性剂解折叠的抗逆性也同时得到了提升，突变体的热半解折叠温度（Tm）和尿素半解折叠浓度（Cm）较野生型分别提高了3.6°C和0.5M。大多数突变体在提高稳定性的同时，保持了良好的催化活性，突变体L278M的催化效率（kcat/Km）较野生型提高了40%。其次，我们针对整个酶分子中的高B因子残基（R249，R309，R242，E269，L219，K13，P218），即酶分子表面区域的位点构建了饱和突变库，并在相同条件下进行动力学稳定性的筛选，结果没有得到稳定性明显提高的突变体，表明较蛋白质整体而言，活性中心高B因子残基的改造是一种更快速、高效的蛋白质工程策略。（2）酶动力学稳定性提高的结构基础。我们使用X-ray衍射的方法对野生型及突变体进行结构解析。通过对比野生型和最优突变体D223G/L278M的晶体结构，我们发现D223G/L278M中，Pro268，Lys271，Ala274，Ala275和Ala279的主链氧原子发生了0.2-0.4的偏移，而Ala276，Leu277和Ala279的主链氮原子发生了0.2–0.5的偏移。正是这一系列的氨基酸位置的微小变化，在位于活性中心的10螺旋上形成了一个连续的主链间的氢键网络。相对B因子分析表明，新的氢键网络有效的降低了突变体中10螺旋的相对B因子值，使得10螺旋刚性增强，提升了活性中心的刚性，从而提升酶的动力学稳定性。在不同温度下进行分子动力学模拟，我们发现在高温条件下，最优突变体D223G/L278M的10螺旋的RMSF更低，说明双点突变在高温条件下有效地保持了活性中心的刚性。相对B因子分析和分子动力学模拟均表明，增强活性中心刚性是提升酶动力学稳定性的有效策略。结构分析表明在保持酶活性中心原有骨架基础上，提高其内部二级结构稳定性是改善酶动力学稳定性的有效手段。（3）酶活性中心改造对酶稳定性及催化活性的共进化。我们通过分子对接的方法获得了酶活性中心中可能影响酶活力的靶标位点，通过构建和筛选饱和突变库，成功获得了催化效率较野生型分别提高26倍和33倍的突变体A281F和I285F。我们将热稳定性提高的突变与活力提高的突变体进行了组合，发现在三点突变体D223G/L278M/A281F中这两种优秀性质能够共同进化，酶的热稳定性及催化效率较野生型分别有6.5倍和10倍的提升。我们通过对酶活性中心的改造，成功实现酶双功能的共进化，也为未来蛋白质工程提供有效的指导。本论文提出了“酶活性中心稳定化”策略，从区域稳定化的角度揭示了酶活性中心刚性对酶动力学稳定性的影响。该研究有望为生物催化提供高稳定性的新酶源，还可能为合成生物学设计、定制新型生物元件提供指导。