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类胰岛素信号途径（Insulin-like signaling pathway）广泛参与了昆虫的物质代谢、生长发育、衰老和寿命等生理过程的调控,其作用机制一直备受关注。烟草甲Lasioderma serricorne是一种世界性分布的仓储害虫,主要以幼虫蛀食危害粮食、烟草、茶叶、中药材等多种储藏物。由于化学熏蒸剂长期不合理使用,加之烟草甲体小、发育历期短、繁殖力强等特点,近年来其抗药性显著提高,造成防控中用药量增大,带来农产品质量安全和环境污染等风险。因此,探索烟草甲新的防控方式和开发新型特异性控制剂显得尤为迫切。生殖是昆虫种群维持和延续至关重要的因素,通过扰乱或阻碍昆虫正常的生殖发育成为害虫防治研究的热点领域。筛选昆虫生殖发育调控的关键因子并明确其分子机理为害虫防控提供了新思路和新方向。因此,本研究以烟草甲类胰岛素信号途径为中心,利用比较转录组学、qPCR、RNAi以及双荧光素酶报告系统等技术和手段,全面注释烟草甲类胰岛素信号途径基因并鉴定其信号转导系统,分析其对烟草甲生殖发育的影响,初步提出miR-9c-5p-Akt-Vg调控烟草甲卵巢发育的分子机理。主要研究结果如下:1烟草甲蛹-成虫（雌）转录组及差异表达基因分析通过比较转录组分析,对烟草甲雌虫卵巢发育关键期3个时间点（3日龄蛹、1日龄成虫和5日龄成虫）9个样品进行基因注释和鉴定,共检测到11,291个基因,其中已知基因为10,369个,预测到新基因922个。比较表达量共鉴定到2,524个显著差异表达基因,其中1,024个上调,1,500个下调。对差异基因进行GO功能富集分析,发现在两组差异表达基因中均显著富集的功能类别涵盖分子功能和生物学过程两大类,涉及角质层的结构成分、几丁质代谢过程和含氨基葡萄糖的化合物代谢过程等。对烟草甲雌虫发育过程中共表达的基因簇进行KEGG分类富集,发现涉及生殖系统发育的途径有孕酮介导的卵母细胞成熟途径、PI3K-Akt信号途径、雌激素信号途径和昆虫激素生物合成途径等。针对在卵巢发育过程中持续上调表达的LsVg和LsVgR,通过RNAi技术明确其能够通过降低卵黄原蛋白的含量阻碍烟草甲卵巢的形态发育、卵黄沉积和卵子的形成,进而影响卵的孵化率。2烟草甲类胰岛素信号途径基因的注释和表达模式分析利用RT-PCR技术克隆获得了烟草甲7个类胰岛素信号途径基因LsInR1、LsInR2、LsIRS、LsPI3K21B、LsPI3K92E、LsPDK和LsAkt的开放阅读框,长度分别为2943、3696、2967、2271、3181、1419和1614 bp,编码980、1231、988、756、1060、472和537个氨基酸。其中LsInR1、LsInR2、LsPI3K21B、LsPI3K92E、LsPDK和LsAkt属于蛋白激酶C家族成员;LsIRS属于PH超基因家族。系统发育分析表明,烟草甲类胰岛素信号途径基因分别与各自家族的基因聚为一支,且均与鞘翅目昆虫的亲源关系最近。LsInR1、LsIRS、LsPI3K92E、LsPDK和LsAkt主要在烟草甲蛹期表达,而LsInR2和LsPI3K21B主要在成虫期表达。LsInR1、LsInR2、LsIRS、LsPI3K92E和LsPI3K21B在中肠的表达量较高,LsAkt在成虫的鞘翅和卵巢中高表达,而LsPDK在头部表达量较高。激素诱导结果表明,烯虫酯和牛胰岛素能够促进烟草甲的卵巢发育,并诱导了7个类胰岛素信号途径基因的表达;20E处理烟草甲蛹后其卵巢发育明显滞后,也显著下调了LsAkt的表达,但其它基因的表达均被20E不同程度的诱导。3类胰岛素信号途径调控烟草甲的生长发育通过RNAi技术解析烟草甲7个类胰岛素信号途径基因的功能。结果表明,对3日龄雌蛹分别注射LsInR1、LsInR2、LsIRS、LsPI3K92E、LsPI3K21B、LsPDK和LsAkt的dsRNA后,所有基因的转录水平较注射dsGFP组均显著下调。其中,LsInR2、LsPI3K92E、LsPDK和LsAkt基因沉默后,雌成虫卵巢发育不健全,产卵历期缩短,卵巢管长度减小,导致其产卵量及后代卵的孵化率显著降低,并影响烟草甲蛋白质合成、糖摄取与代谢以及保幼激素信号途径基因的表达。LsInR1、LsIRS和LsPI3K21B的表达被抑制后,蛹的蜕皮发育受阻,形成畸形翅,导致烟草甲的存活率显著降低,其蜕皮激素合成及信号转导、几丁质代谢和翅发育相关基因的表达量明显下降。推测类胰岛素信号途径可能参与蛋白质储存、糖分摄取、脂类合成、几丁质代谢和翅发育等过程,进而调控昆虫的蜕皮和生殖发育。4 miR-9c-5p靶向LsAkt调控烟草甲卵巢发育的分子机制烟草甲LsAkt表达被抑制后,其葡萄糖、糖原和海藻糖含量均明显降低,保幼激素滴度和卵黄原蛋白含量也显著降低。为进一步明确该基因的表达调控机制,利用4种经典软件预测得到可能调控LsAkt的miRNA（miR-9c-5p）。蛹-成虫期的qPCR结果显示,miR-9c-5p与LsAkt有相反的表达模式。3日龄雌蛹注射miR-9c-5p类似物后,导致羽化5 d后雌成虫的卵巢发育迟缓,输卵管变短,侧输卵管增长。双荧光素酶报告系统表明,LsAkt构建的双荧光素酶报告载体与miR-9c-5p类似物共转染时显著降低荧光素酶信号,表明miR-9c-5p与LsAkt基因存在靶向关系,miR-9c-5p能够有效地抑制LsAkt的表达。因此,miR-9c-5p通过靶向LsAkt调控雌虫的卵巢发育,进而影响烟草甲的生殖发育。