最近几年,在我国肉鸭养殖地区出现一种以脾脏坏死为特征的疾病,该病主要造成患鸭大群精神状态差,饮水、采食均出现下降并伴有死亡,脾脏坏死后机体免疫力下降容易继发感染造成更高的死亡率,耐过鸭发育受阻、生长缓慢,成为僵鸭。目前,大多数研究者认为新型鸭呼肠孤病毒(New type duck reovirus,NDRV)是造成该病的主要病原,针对该病发病日龄小、病情发展快、容易快速传播的特点,急需建立一种快速、精确、可靠的检测方法应用于该病早期定性与定量诊断。本研究从患鸭的坏死脾脏中分离到一株NDRV,对分离的毒株进行了序列分析及致病性研究。针对该病建立了TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并利用该方法对病毒在感染肉鸭不同组织器官中的分布、排毒规律及病毒血症情况进行了监测,为该病的防控提供了理论依据。根据NDRV S2基因序列设计一对引物和一条特异性探针,扩增长度85 bp。将扩增的片段连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、测序鉴定后,倍比稀释作为标准品,优化反应条件后构建标准曲线,建立检测NDRV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法。该方法的标准曲线有良好的线性关系,线性回归方程为y=-3.3468x+41.681,相关系数R~2为0.9988;敏感性良好,最小检出模板浓度为10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;特异性良好,仅能检测NDRV,与其他病毒无交叉反应现象;批间和批内变异系数均在3%以下,重复性良好。以上试验表明,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高,特异性强、重复性好,可用于NDRV的临床检测。180只1日龄健康樱桃谷雏鸭随机分为3组,肌肉接种组、口服接种组和对照组各60只,口服接种组和肌肉接种组1日龄每只接种0.2 mL病毒液,对照组每只接种0.2 mL无菌生理盐水。观察记录雏鸭感染后的临床症状及剖检变化,每隔2d称重用来监测体重增长变化;采集各组泄殖腔棉拭子和抗凝血3份,检测肉鸭的排毒情况及病毒血症情况。于攻毒后12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d,每组随机抽取3只剖杀,将病变组织器官制备石蜡切片,观察其组织病理学变化,同时收取各组织进行病毒载量的测定。结果显示,试验组雏鸭均出现脾脏肿大、出血和坏死;试验组雏鸭体重增长缓慢,以口服接种组最为显著;棉拭子排毒规律结果显示,两组均在感染早期出现排毒;血液中病毒载量变化结果显示,两组均在感染早期检测到病毒存在,且含量变化与棉拭子排毒规律基本一致;组织病毒载量结果显示,人工感染SDYC株后,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、十二指肠、胃、法氏囊、胸腺、脑中均能检测到病毒,两组病毒含量较高的器官为脾脏、胸腺和法氏囊,可作为检测该病的优选器官。1日龄健康罗斯308肉鸡和SPF鸡随机分为肌肉接种组、口服接种组和对照组,口服接种组和肌肉接种组1日龄每只接种0.2 mL病毒液,对照组每只接种0.2 mL无菌生理盐水。观察记录雏鸡感染后的临床症状及剖检变化。结果显示SPF雏鸡和肉鸡攻毒后肌肉接种组均出现精神沉郁和死亡,其中SPF雏鸡肌肉接种组死亡率高达100%,肉鸡肌肉接种组死亡率达到71.4%;口服接种组和对照组无明显变化。死亡雏鸡剖检病变大体一致,主要包括:腹腔有大量腹水;肝脏和脾脏肿大、出血、出现大面积坏死灶。说明NDRV在生产中有跨种传播感染鸡群的可能,要加强生物安全的防范。