【摘 要】
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目的:探究黄芪甲苷(As-Ⅳ)对抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤的自噬调节研究及其与黄芪甲苷上调14-3-3η蛋白之间的关系。方法:此实验使用H9c2细胞,As-Ⅳ预处理进行营养预适应并构建缺氧复氧损伤模型。随机地把来自同一批的细胞分成6组进行实验:(1)Control组;(2)A/R组;(3)50μM As-Ⅳ+A/R组;(4)50μM As-Ⅳ+AD14-3-3ηRNAi+A/R组;(5)50μM
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目的:探究黄芪甲苷(As-Ⅳ)对抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤的自噬调节研究及其与黄芪甲苷上调14-3-3η蛋白之间的关系。方法:此实验使用H9c2细胞,As-Ⅳ预处理进行营养预适应并构建缺氧复氧损伤模型。随机地把来自同一批的细胞分成6组进行实验:(1)Control组;(2)A/R组;(3)50μM As-Ⅳ+A/R组;(4)50μM As-Ⅳ+AD14-3-3ηRNAi+A/R组;(5)50μM As-Ⅳ+ADBeclin1RNAi+A/R组;(6)50μM As-Ⅳ+3-MA+A/R组,每组重复三次实验。细胞的存活率采取CCK-8的方法测定,酶标仪检测LDH外漏程度;Western blotting(免疫印迹)分析蛋白14-3-3η,P62,LC3和Beclin1的表达;LysoTracker染色检测溶酶体酸化水平;流式细胞仪测定细胞活性氧(ROS)水平、线粒体膜电位(MMP)的变化和mPTP开放程度,Annexin V-FITC/PI双染法以及TUNEL染色法检测细胞凋亡。结果:经A/R处理后对所有组的H9c2细胞进行分析:1.As-Ⅳ预处理能提高H9c2细胞的存活率,使LDH外漏程度下降并使细胞内14-3-3η蛋白表达水平升高。2.下调蛋白14-3-3η消除了As-Ⅳ预处理对细胞存活率力提高以及使LDH外漏程度下降的保护作用。3.As-Ⅳ预处理上调P62、降低LC3-II/I比值以及降低Beclin1蛋白表达;感染AD1433ηRNAi下调14-3-3η表达后可以逆转上述作用。溶酶体荧光分子探针LysoTracker Red检测结果显示A/R损伤后H9c2细胞荧光增强,As-Ⅳ预处理后细胞红色荧光强度减弱;感染AD1433ηRNAi后,As-Ⅳ预处理导致溶酶体的pH值保持在低水平,细胞荧光明显增强。4.As-Ⅳ预处理组、感染ADBeclin1RNAi后的As-Ⅳ预处理组或As-Ⅳ预处理后添加3-MA的组别能显著减少ROS爆发,稳定细胞膜电位,抑制mPTP开放,降低细胞凋亡;感染AD1433ηRNAi后消除了As-Ⅳ预处理对H9c2细胞的以上作用。这些结果皆存在统计学意义。(P<0.01)结论:对抗A/R损伤中,黄芪甲苷预处理通过上调14-3-3η蛋白,调控Beclin1依赖性自噬通路降低自噬,发挥对H9c2细胞的保护作用。
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