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口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)感染偶蹄动物所引起的急性和高度接触性传染病，严重威胁全球畜牧业的发展与食品安全，目前尚无有效的防治措施。病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)是一种无致病性的笼状蛋白质颗粒，其抗原主要被MHC-Ⅰ类分子提呈，但对固有免疫识别VLP的机制尚不清楚。肥大细胞是固有免疫的效应细胞，并在适应性免疫应答过程中发挥启动与调节作用，尽管近年来对肥大细胞在抗病毒感染中的作用研究取得了一定进展，但对肥大细胞在抗FMDV感染中的作用仍不清楚。 本文首先构建重组质粒pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4、pcDNA3.1(+)-HBcAg和pcDNA3.1(+)-VP1-VP4，然后将其通过脂质体2000瞬时转染到HEK-293T细胞中，使其分别表达VLP、HBcAg和VP1-VP4蛋白。免疫印迹检测结果显示，VLP的分子量约为47 kDa，用透射电镜观察经磷钨酸负染的VLP，可见直径约为30 nm的病毒样颗粒结构，表明VLP制备成功。 用VLP负载经TLR2、TLR4、甘露糖受体(mannose receptor, MR)和清道夫受体(scavenger receptor，SR)抑制剂分别处理的小鼠腹腔肥大细胞(peritoneal mast cells,PMC)，以HBcAg和VP1-VP4蛋白分别负载上述PMC为对照，并设空白PMC对照，分别在15min、30min、45 min和60 min收集上清液，用ELISA检测PMC上清中β-氨基己糖苷酶(β-hexosami-nidase，β-Hex A)的含量变化，以反映PMC的脱颗粒情况。结果显示:抑制TLR2和SR的PMC负载VLP的上清中β-Hex A含量极显著低于对照组(p＜0.01)。抑制TLR2和TLR4的PMC负载VP1-VP4的上清中β-HexA含量显著高于对照组(p＜0.05)。其余的抑制受体的上清中β-Hex A含量与对照组相比较均无统计学意义。 用重组FMDV VP1-VP4蛋白负载经MR抑制剂处理的PMC，在24h收集PMC上清液，用蛋白芯片检测PMC识别VP1-VP4后的蛋白质表达谱。结果显示，与PMC组相比，VP1-VP4组的PMC上清中的I-TAC、TARC和L-Selectin等12个蛋白质分子为上调的差异表达。与VP1-VP4组相比，MR组的PMC上清中的IL-13、IFN-γ和MIP2等52个蛋白质分子为上调的差异表达。 用VLP负载经TLR2、TLR4、MR和SR抑制剂分别处理的PMC，以HBcAg和VP1-VP4蛋白负载上述PMC作为对照，分别在6h，12h，24h和48h收集PMC上清液，用ELISA检测PMC上清中TNF-α、IL-6、IL-10含量，结果发现，抑制TLR2的PMC负载VLP，在1h的PMC上清中只有IL-6含量极显著高于对照组(p＜0.001)，在6h的PMC上清中只有TNF-α和IL-6含量极显著高于对照组(p＜0.001)，在24h和48h的上清中只有TNF-α和IL-6含量极显著低于对照组(p＜0.001)。与之不同的是，抑制TLR2的PMC负载HBcAg和VP1-VP4后的24h，上清中IL-6含量极显著高于对照组(p＜0.001)，这提示VLP可以缓解由TLR2介导的VP1-VP4抑制PMC分泌IL-6的作用。 抑制TLR4的PMC负载VLP，在四个时间点中只有48h的PMC上清中TNF-α含量极显著低于对照组(p＜0.001)，这个变化与抑制TLR4的PMC负载VP1-VP4的上清中含量的变化趋势是一致的，在1h的上清中只有IL-6含量极显著高于对照组(p＜0.001)，在6h的PMC上清中只有IL-10含量显著高于对照组(p＜0.001)，在6h和24h的PMC上清中只有IL-10含量显著低于对照组(p＜0.05)，在48h的上清中IL-6和IL-10含量极显著低于对照组(p＜0.001)。其中，抑制TLR4负载HBcAg的上清中所检测的三种细胞因子的含量变化趋势与负载VLP的均相同。这表明，在48h之前，PMC识别VLP后所分泌的TNF-α不是由TLR4介导的。VLP被PMC识别后，在不同的时间点TLR4介导IL-6和IL-10的分泌亦或是抑制其分泌。 抑制MR的PMC负载VLP，在1h和6h的PMC上清中只有TNF-α和IL-6含量极显著高于对照组(p＜0.001)，在24h的上清中只有IL-6含量极显著的高于对照组(p＜0.001)，但是与之不同的是在抑制MR负载VP1-VP4后的24h，上清中TNF-α和IL-6含量仍然极显著高于对照组(p＜0.001)，在48h的上清中只有TNF-α和IL-10含量分别极显著的低于和高于对照组(p＜0.001)。这表明，PMC识别VLP后对TNF-α和IL-6的分泌受到抑制，且在48h时IL-10的分泌也受到抑制，这种抑制是由MR所介导的，结果还说明了VLP可以将MR所介导的抑制PMC分泌TNF-α和IL-6的时间缩短。 抑制SR的PMC负载VLP，在1h的PMC上清中只有TNF-α和IL-6含量极显著高于对照组(p＜0.001)，在6h的PMC上清中IL-10含量极显著低于对照组(p＜0.001)，但是在24h的上清中TNF-α、IL-6和IL-10含量与对照组相比较无统计学意义，在48h的上清中只有TNF-α和IL-6含量极显著低于对照组(p＜0.001)。这表明，在PMC识别VLP后的，可以引起PMC分泌TNF-α和IL-6。 以上结果表明，PMC识别VLP所发生的脱颗粒主要是由TLR2和SR介导的，TLR2介导TNF-α分泌和抑制IL-6分泌，TLR4主要介导TNF-α和IL-10的分泌，PMC分泌TNF-α和IL-6是由SR介导，而抑制TNF-α、IL-6和IL-10分泌主要是由MR介导的。