[研究背景]脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征,其主要特征为宿主的炎性反应通路被激活,细胞因子和炎性介质过度释放,进一步发展可致严重脓毒症,脓毒症休克甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。脓毒症是急诊、重症监护病房(ICU)常见的危急重症,也是ICU死亡的主要原因,在发达国家和发展中国家都有很高的发病率和死亡率,每年约有1800万人死于脓毒症[2],脓毒症引发的多器官功能障碍综合征被认为是良性疾病的第一死因。尽管当前现代医学对于脓毒症的基础研究和临床研究仍在不断深入探索之中,同时也已取得一定的成效,但是结果仍不乐观。现代医学通过对脓毒症的长期研究已经认识到：脓毒症时机体处于一个免疫失衡状态,早期的促炎症阶段(Proinflammatory stage)主要是以肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)等促炎症因子的释放为主,这些炎症因子活化中性粒细胞,促进中性粒细等炎性细胞的渗出,增加内皮细胞黏附、内皮细胞和单核细胞表达的组织因子,引起机体过度的炎症反应形成“细胞因子风暴”。但是过量的促炎因子也不可避免的对机体造成严重损失,如致使血管内皮细胞损伤,血管通透性增强,组织液的渗出,影响氧气的交换；同时内皮细胞的损伤会激活凝血系统,加上脓毒症时血小板处于激活状态,大量微血栓会在微循环之中形成,这样便进一步导致组织氧供及营养通路的阻断,其结果便是多器官功能障碍综合征(MODS)[6]。有研究表明在脓毒症的后期,机体处于免疫抑制阶段,即代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS),对机体造成二次感染,在此阶段脓毒症患者体内的免疫细胞对外来的抗原反应性降低,同时部分的免疫细胞也会发生调亡和坏死。此时一些抑制炎症的细胞因子如1L-10的血清水平会上升,TNF-a的量反而降低。大量研究表明脓毒症后期发生免疫抑制是患者预后差的重要原因之一。近年来关于脓毒症发病机制的研究主要集中于线粒体功能障碍(Mitochondria dysfunction),线粒体是细胞中重要的细胞器,也是脓毒症时损伤的主要靶器官。线粒体通过氧化磷酸化反应为机体提供ATP,调控细胞信号转导,细胞凋亡和基因表达等,对机体生长、代谢、疾病的发生发展等多方面都有重要意义。脓毒症时由于内毒素和大量炎性介质释放,活性氧族物质的产生,谷胱甘肽水平的降低,这一系列改变不仅会损伤线粒体结构,同时会影响细胞内氧化磷酸化的过程,使得细胞ATP的供给不足,终致各脏器功能衰竭。线粒体受损和脏器衰竭程度与脓毒症的预后密切相关。肝脏不仅启动脓毒症多器官功能衰竭的进程,亦是脓毒症发生发展过程中最易受损的器官之一,发生率高达34.7%,合并MODS的发病中出现最早、程度最显著。肝细胞线粒体是机体进行三大营养物质和能量代谢的中心,是乳酸循环(Cori cycle)、丙氨酸-葡萄糖循环(alanine-glucose cycle)和鸟氨酸循环(Ornithine cycle)等发生的唯一场所,对维持肝脏正常功能起重要作用。且肝细胞线粒体在调节细胞内钙离子浓度、信息传递和细胞凋亡等方面也起着重要作用。因此深入研究脓毒症肝脏线粒体损伤的机制对临床脓毒症的治疗和预后具有重大意义。醒脑静注射液是中药安宫牛黄丸的精制静脉注射液,也是临床上常用的中药复方制剂,主要由麝香、郁金、栀子和冰片组成,对各种病因引起的意识障碍以及高热等有显著疗效,临床主要用于治疗中风、颅脑损伤、中枢神经系统感染、药物中毒、肝性脑病等引起的意识障碍,有效率高达86.72%。醒脑静可清除氧自由基,减轻氧化应激损伤,抗炎并调节免疫,保护血管内皮细胞,减少微血栓形成并改善微循环功能,有效降低细胞炎症反应,促进细胞的修复和再生。[研究目的和意义]基于上述研究背景,以及醒脑静的药物机制多用中医理论阐释,难以向国外进行推广应用的限制性,本实验旨在发挥祖国传统医学的优势,探讨应用复方中药制剂醒脑静注射液对脓毒症患者肝损伤的作用机制及临床疗效。研究中通过观察醒脑静对脓毒症大鼠血清炎症因子水平(TNF-α、IL-6、IL-1β)、肝生化指标(ALT、AST)、肝线粒体氧化应激指标(Mn-SOD、MDA、NO和iNOS)以及肝脏及线粒体病理学改变的作用,探讨醒脑静注射液对脓毒症肝损伤大鼠是否具有保护作用以及相关机制,并探索干预时点及干预途径的不同对干预效果的影响,为进一步的前临床试验提供相关试验动物水平研究资料,以期为临床合理用药提供实验室基础。[研究方法]1.动物模型的分组与建立无特定病原体(SPF)级雄性大鼠70只,体重220-250g,按随机数表法分成7组,每组10只,分别为正常对照组；6小时脓毒症组(LPS-6h组),24小时脓毒症组(LPS-24h组),48小时脓毒症组(LPS-48h组),6小时静脉醒脑静组(XNJ-6h组),24小时静脉醒脑静组(XNJ-24h组),48小时静脉醒脑静组(XNJ-48h组)。给予正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水10ml/kg体重建立正常对照组动物模型；给予脓毒症组大鼠腹腔注射LPS溶液10ml/kg体重建立大鼠脓毒症模型。参照醒脑静药品说明书,将人给药剂量转换为大鼠给药剂量,以尾静脉注射给药后放回笼内,正常饮水进食。2.各项指标的检测方法2.1大鼠一般状况观察造模后各组大鼠6h、24h和48h的精神状况,有无立毛,寒战、腹泻和出血倾向,并测量体温、心率和呼吸频率等基本生命体征,检测血清LPS浓度。2.2大鼠生化指标运用全自动生化分析仪检测各组大鼠各时点下血清CRP、ALT、AST水平。2.3大鼠血清炎症反应指标运用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测各组大鼠各时点下血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。2.4肝脏线粒体氧化应激反应指标采用黄嘌呤氧化酶法测定各组大鼠肝线粒体Mn-SOD活性；采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定各组大鼠肝线粒体MDA活性；采用硝酸还原酶法测定各组大鼠肝线粒体NO含量；采用L-精氨酸氧化法测定各组大鼠肝线粒体iNOS含量。2.5肝脏线粒体损伤相关指标采用普利莱线粒体/胞浆制备试剂盒提取肝线粒体,一部分制作线粒体电镜超薄切片电镜下观察肝线粒体形态结构,按Flameng法对线粒体进行半定量评分；一部分进行JC-1染色,流式细胞仪检测线粒体膜电位。2.6肝脏组织病理损伤制作石蜡切片于光学显微镜下观察大鼠肝脏组织的病理学改变。3.统计方法对检测所得的数据进行统计描述,正态分布计量资料用均值±标准差(x±s)表示,结果用spss13.0统计软件进行分析；两组间均数比较采用两独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,其中方差齐者用LSD法,方差不齐者用Games-Howell法分析组间差异。两组资料间相关性分析采用Pearson相关分析；P<0.05为差异具有统计学意义。[研究结果]1.动物一般状况正常组大鼠一般状况良好,心率、呼吸频率和体温等基本生命体征平稳。而醒脑静组大鼠在腹腔注射LPS一小时内均出现反应差,嗜睡,立毛甚至出血倾向等脓毒症状态。XNJ组较LPS组大鼠一般状况有好转,死亡率有所降低。2.大鼠体内内毒素水平变化与正常对照组大鼠相比,腹腔注射LPS后,模型组大鼠6h时血清LPS水平迅速升高,而后略有降低直至48h。与正常对照组相比,LPS组和静脉XNJ组血清LPS水平显著升高(P<0.05)。静脉XNJ组与LPS组相比,各时点血清内毒素浓度略有降低,但统计学无明显差异(P>0.05)。3.大鼠血清炎症因子水平变化3.1各组大鼠血清CRP水平变化与正常对照组大鼠相比,LPS组和静脉XNJ组血清CRP水平升高显著(P>0.05),并在48h内持续升高。静脉XNJ组与LPS组相比,6h和24h两时点血清CRP浓度降低显著(P<0.05),48h静脉XNJ组比LPS组血清CRP略有降低,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.2各组大鼠血清TNF-α水平变化与正常对照组大鼠相比,LPS组和静脉XNJ组血清TNF-α水平升高显著,6小时达峰(P<0.05),6小时后开始下降。6h和24h静脉XNJ组与LPS组相比,各时点血清内毒素浓度略有降低,但统计学无明显差异(P>0.05)。48h静脉XNJ组与LPS组相比,TNF-α水平有显著降低(P<0.05)。3.3各组大鼠血清IL-6水平变化与正常对照组大鼠相比,LPS组和静脉XNJ组血清IL-6水平升高显著,6小时达峰(P<0.05),6小时后开始下降。6h静脉XNJ组与LPS组相比,血清IL-6浓度有所降低,但统计学无显著差异(P>0.05)。24h和48h静脉XNJ组与LPS组相比,IL-6水平明显降低(P<0.05)。3.4各组大鼠血清IL-1β水平变化与正常对照组大鼠相比,LPS组和静脉XNJ组血清IL-1β水平升高显著,6小时达峰(P<0.05),6小时后开始下降。6h和48h两个时点的静脉XNJ组与LPS组相比,血清IL-1p浓度都有所降低,但统计学无差异(P>0.05)。24h静脉XNJ组与LPS组相比,IL-6水平有显著降低(P<0.05)。4.大鼠肝功能指标各组大鼠血清ALT和AST水平的比较与正常对照组大鼠相比,LPS组血清ALT和AST均有显著升高(P<0.05),而静脉XNJ组升高水平无统计学差异(P>0.05)。静脉XNJ组与LPS组相比,在6h和24h时点上,ALT,AST水平都有显著降低(P<0.05),而在48h时点有降低趋势,但统计学无差异(P>0.05)。5.大鼠肝病理切片镜下观察正常对照组肝细胞形态正常。LPS组大鼠6h即出现肝细胞水肿样变,有炎症细胞浸润和红细胞渗出；24h大鼠肝细胞水肿加重,炎症细胞渗出严重并伴有弥漫性出血；48h组肝细胞出现弥漫性空泡变性、肝窦扩张内伴大量炎性细胞浸润及肝细胞局灶状坏死。各组对比后发现,大鼠肝脏在注射LPS后48小时病理损伤最严重。而各时点,醒脑静注射组较LPS组有所改善。6.大鼠肝脏氧化应激反应指标6.1各组大鼠肝线粒体Mn-SOD水平变化与正常对照组大鼠相比,LPS组和静脉XNJ组线粒体Mn-SOD含量显著升高(P<0.05),6小时达峰。6h和24h两个时点的静脉XNJ组与LPS组相比,血清肝线粒体Mn-SOD水平都有显著降低(P<0.05),48h静脉XNJ组与LPS组相比,线粒体Mn-SOD含量水平略低,但差异无显著性(P>0.05)。6.2各组大鼠肝线粒体MDA水平变化各组大鼠间肝脏组织线粒体MDA含量无显著差异(P>0.05)。6.3各组大鼠肝线粒体NO水平变化与正常对照组大鼠相比,LPS组和静脉XNJ组血清NO水平升高显著,6小时达峰(P<0.05),6小时后开始下降。各个时点的静脉XNJ组与LPS组相比,线粒体NO含量都略有降低,但差异均无显著性(P>0.05)。6.4各组大鼠肝线粒体iNOS水平变化与正常对照组大鼠相比,LPS组和静脉XNJ组线粒体iNOS水平显著升高(P<0.05),6小时达峰后逐渐降低。各个时点的静脉XNJ组与LPS组相比,线粒体iNOS含量都略有降低,以24h降低程度具显著性(P<0.05)。7.大鼠肝线粒体膜电位及电镜下半定量评分正常对照组大鼠肝脏线粒体形态正常,边界清楚,基质均匀,线粒体嵴清晰可见；与正常对照组相比,LPS-6h组少数线粒体轻度肿胀,线粒体嵴模糊,内膜和外膜完整,未见破碎线粒体；LPS-24h组部分线粒体肿胀明显,线粒体嵴消失,内膜和外膜模糊不清；LPS-48h组可见线粒体出现不同程度的肿胀,空泡样改变,基质密度减少甚至基质凝固和嵴断裂。醒脑静注射组与LPS组相比,肝脏线粒体形态有所改善。电镜半定量分析结果表明：与正常对照组相比,腹腔注射LPS后6h,LPS组和静脉XNJ组肝脏线粒体电镜半定量评分呈上升趋势,24h肝脏线粒体电镜半定量评分达到最高峰,48h评分有所降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。静脉XNJ组与LPS组相比,24h和48h电镜下半定量评分都显著低于LPS组,(P<0.05)。提示醒脑静对肝线粒体有一定保护作用。8.相关性分析8.1.各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平与肝脏组织线粒体Mn-SOD, MDA,NO,iNOS活性相关性分析大鼠血清TNF-α水平与肝脏组织线粒体Mn-SOD、NO、iNOS活性呈正相关,相关系数分别为0.58(P=0.021),0.463(P=0.007)和0.414(P=0.017)。血清TNF-α水平与MDA活性间无明显相关性(r=-0.206,P=0.249)。大鼠血清IL-6水平与肝脏组织线粒体Mn-SOD、NO、iNOS活性呈正相关,相关系数分别为0.832(P=0.000),0.68(P=0.000)和0.589(P=0.000)。血清IL-6水平与MDA活性间无明显相关性(r=-0.236,P=0.153)。大鼠血清IL-1p水平与肝脏组织线粒体Mn-SOD、NO、iNOS活性亦呈正相关,相关系数分别为0.892(P=0.000),0.716(P=0.000)和0.591(P=0.000)。血清IL-1β水平与MDA活性间无明显相关性(r=-0.153,P=0.361)。8.2.大鼠血清ALT.AST水平与肝脏组织线粒体Mn-SOD,MDA,NO, iNOS活性相关性分析大鼠血清ALT水平与肝脏组织线粒体Mn-SOD活性、NO浓度、iNOS活性呈正相关,相关系数分别为0.429(P=0.007),0.507(P=0.001)和0.382(P=0.018)。血清ALT水平与线粒体MDA活性间无明显相关性(r=-0.153,P=0.361)。大鼠血清AST水平与肝脏组织线粒体Mn-SOD活性、NO浓度、iNOS活性呈正相关,相关系数分别为0.434(P=0.006),0.472(P=0.003)和0.286(P=0.082)。血清AST水平与线粒体MDA活性间无明显相关性(r=0.019,P=0.090)。8.3.大鼠血清生化指标与肝脏组织线粒体膜电位的相关性分析脓毒症大鼠血清炎性介质TNF-a和IL-6水平与肝脏组织线粒体膜电位存在负相关关系,相关系数分别为-0.456(P=0.008)和-0.242(P=0.044)。脓毒症大鼠血清ALT、AST水平升高的同时,肝脏组织线粒体膜电位随之降低,其相关系数分别为-0.374(P=0.021)和-0.347(P=0.033)。[结论]1.肝损伤发生于脓毒症早期,此损伤与过量炎症因子释放,线粒体氧化应激损伤存在相关性。2.醒脑静对脓毒症时炎症因子的释放及线粒体氧化应激损伤有抑制作用,提示醒脑静注射液对脓毒症大鼠肝损伤有保护作用。