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背景脑水肿不仅可以导致脑细胞功能障碍,而且可造成颅内高压,影响脑的血液灌流,甚至形成脑疝而致病人死亡。脑水肿的发生与脑内水转运异常有关。水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)是一种水转运蛋白,它在脑内呈极性分布于胶质细胞膜上,包括星形胶质细胞在微血管周围形成的细胞足突,软脑膜内表面形成的胶质界膜和室管膜细胞的基底膜等部位。这些部位都是脑实质与脑血管或脑脊液相交界的部位,提示AQP4的这种极性分布形式在脑实质与脑血管/脑脊液的水转运过程中发挥重要作用。脑水肿主要有细胞毒性和血管源性两种类型,细胞毒性脑水肿的形态学特点主要表现为水分在细胞内滞留,细胞肿胀,但血脑屏障保持完整;而血管源性脑水肿则表现为水分在细胞间聚集,细胞间隙增大,血脑屏障破坏。AQP4在不同类型脑水肿中的作用不同。AQP4表达增加可促进经AQP4转运进入细胞内的水分,从而加重细胞毒性水肿;而AQP4表达增加却有利于细胞间隙多余水分的清除,从而减轻血管源性水肿。因此,对于不同类型的脑水肿,针对AQP4有不同的治疗策略:抑制AQP4的水转运功能有利于减轻细胞毒性水肿;而促进AQP4的水转运功能有利于减轻血管源性脑水肿。在脑缺血、癫痫和颅内肿瘤等多种疾病造成脑水肿的动物和患者脑内,AQP4的蛋白表达水平和极性分布形式发生改变,但是其机制仍不明确。有资料显示,包括AQP4在内的部分膜蛋白可以从细胞膜内化(internalization)至细胞内,同时伴随其水转运功能的改变。内化进入细胞内的膜蛋白可被分选(sorting)至溶酶体,被水解酶降解。脑内疾病所致的AQP4极性分布的改变是否与其内化和分选过程有关,目前未见报道。如果证实在脑水肿的发生过程中存在AQP4内化和溶酶体分选的现象,将为针对AQP4对脑水肿进行治疗的策略提供新思路。促进AQP4的内化和溶酶体降解,以减少在细胞膜上发挥水转运功能的AQP4,进而减少通过AQP4进入细胞内的水分,将有利于减轻细胞毒性脑水肿;而抑制AQP4的内化和溶酶体降解将使AQP4仍呈极性分布于胶质细胞膜上,有利于促进细胞间隙中多余水分的清除以减轻血管源性脑水肿。目的在大鼠脑缺血和细菌性脑膜炎这两种模型中,研究在脑水肿的发生发展过程中,是否存在AQP4内化和溶酶体分选的现象并对其机制进行初步探讨。内容和方法本研究包括两部分:第一部分,研究在大鼠缺血性脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选,并对其机制进行初步探讨;第二部分,研究在大鼠脑膜炎脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选。第一部分⑴研究在大鼠缺血性脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选:用线栓法制作大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的大鼠脑缺血模型;采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride, TTC)染色方法观察脑内缺血的部位和程度;采用透射电镜观察脑缺血早期脑内的超微结构,以明确脑水肿的类型;运用免疫荧光双标的方法检测AQP4分别与早期内涵体标记物(early endosome antigen-1, EEA1)和溶酶体标记物(lysosomalassociated membrane protein-1, LAMP1)的共定位,运用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量AQP4与EEA1/LAMP1共表达的比例。⑵初步探讨AQP4内化和溶酶体分选的机制:在脑缺血模型中,经颈外静脉注射蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)激动剂佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate, PMA),采用干湿重法、透射电镜观察及Western Blot分别检测脑含水量,星形胶质细胞水肿程度和AQP4蛋白的表达;采用免疫荧光双标检测AQP4分别与EEA1及LAMP1的共定位,运用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量AQP4与EEA1/LAMP1共表达的比例。第二部分大鼠脑膜炎脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选:经幼鼠延髓小脑池注入B族溶血性链球菌(group B hemolyticStreptococcus, GBS)建立细菌性脑膜炎模型;采用干湿重法、伊文思蓝(Evans Blue, EB)含量测定法、透射电镜观察、Western Blot等分别检测脑膜炎幼年大鼠脑含水量、血脑屏障通透性以及AQP4,α-dystroglycan(α-DG)和β-dystroglycan(β-DG)的表达水平;采用免疫荧光双标检测AQP4分别与早期内涵体标记物EEA1,晚期内涵体标记物甘露糖-6-磷酸受体(mannose-6-phosphate receptor, MPR)及溶酶体标记物LAMP1的共表达,运用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量AQP4与EEA1/MPR/LAMP1共表达的比例。结果第一部分⑴大鼠缺血性脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选:①TTC染色:正常对照组和缺血1h组未见缺血灶;缺血3h,6h,12h,24h组可见缺血灶;②电镜观察:缺血3h时,血管周围胶质细胞肿胀,血管内皮细胞紧密连接未被破坏,血管基底膜完整;③缺血后各组(1h,3h,6h,12h,24h时间点)AQP4与EEA1共表达,共表达比例较对照组增加,差异具有统计学意义(P<0.05);④缺血后各时间点(3h,6h,12h,24h)AQP4与LAMP1共表达,共表达比例较对照组增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。⑵AQP4内化和溶酶体分选机制的研究:①PMA处理后,脑含水量在缺血后1h,3h下降(与溶剂对照组比较,P<0.05);缺血6h及以后各时段,PMA对脑含水量无显著影响(与溶剂对照组比较,P>0.05);②电镜观察:PMA处理后,缺血后(3h)血管周围胶质细胞水肿程度减轻(与溶剂对照组比较,P<0.05);③PMA处理后,缺血后(3h)AQP4表达水平下降(与溶剂对照组比较,P<0.05);④PMA处理后,缺血性脑水肿模型中,AQP4分别与EEA1及LAMP1共表达的比例较溶剂对照组无差异(P>0.05)。第二部分大鼠脑膜炎脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选:①模型组脑含水量较对照组增加,差异具有统计学意义(P<0.05);②模型组EB含量与对照组无统计学差异(P>0.05);③电镜观察:血管周围胶质细胞肿胀,血管内皮细胞紧密连接未被破坏,血管基底膜完整;④模型组AQP4表达水平较对照组增加,差异具有统计学意义(P<0.05);⑤模型组α-DG和β-DG蛋白表达水平较均对照组增加,差异具有统计学意义(P<0.05);⑥模型组中,AQP4分别与EEA1、MPR及LAMP1共表达,共表达比例较对照组增加(P<0.05)。结论1.大鼠缺血性脑水肿模型中,存在AQP4内化和溶酶体分选现象。2. PKC激动剂PMA可下调AQP4的表达并减轻缺血早期细胞毒性脑水肿,但PMA对AQP4表达的下调作用不是通过促进AQP4内化和溶酶体分选实现的。3.大鼠脑膜炎脑水肿模型中,AQP4表达上调,同时存在AQP4内化和溶酶体分选现象。