论文部分内容阅读
为研究斑节对虾(Penaeus monodon)的耐低盐分子机制,开发能够应用于斑节对虾耐低盐新品系选育的分子标记,应用于抗逆性状的育种研究,本文首次克隆了三个斑节对虾耐低盐相关基因的cDNA全长,并进行了生物信息学分析。然后利用实时荧光定量与96h急性盐度胁迫实验的方法研究了三个与耐低盐相关基因在不同组织及低盐胁迫过程中的差异表达情况。从本实验室斑节对虾转录组文库中获得EST序列,利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术得到了三个基因的cDNA全长,之后以基因组DNA为模板设计引物扩增基因组序列,然后以野生群体样品为模板在三个基因的基因组序列上筛选SNP,并挑选质量好的位点进行SNP分型,与耐低盐性状关联分析。斑节对虾葡萄糖转运蛋白-1(PmGLUT1)cDNA全长2023bp,5’非编码区(UTR)276bp,3’UTR 271bp,包括23个碱基的poly(A)尾,开放阅读框(ORF)1476bp,可编码491个氨基酸。预测其分子量为54.179kDa,理论等电点为6.39。序列含有1个糖基化位点,31个磷酸化位点,12个跨膜结构域。通过多重序列比对及系统进化树分析,PmGLUT1与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GLUT1基因同源性最高,达99.59%。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。蜕皮分析发现,鳃组织中PmGLUT1在蜕皮间期表达量最高,蜕皮后期次之,在蜕皮期表达量最低。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中表达量最低。96h急性盐度胁迫分析发现,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。斑节对虾葡萄糖转运蛋白-2(PmGLUT2)cDNA全长2018bp,5’UTR 94bp,3’UTR 352bp,包括29个碱基的poly(A)尾,开放阅读框(ORF)1572bp,可编码523个氨基酸。预测其分子量为56.568kDa,理论等电点为4.96。序列含有4个糖基化位点,55个磷酸化位点,12个跨膜结构域。通过相似性、多重序列比对及进化树分析,PmGLUT2与凡纳滨对虾促进海藻糖转运体Tret1基因同源性最高,达94.77%,与凡纳滨对虾GLUT2基因同源性达60.54%。检测PmGLUT2基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT2的表达量呈先下降再上升的趋势,但无显著性差异。蜕皮分析发现,鳃组织中PmGLUT2在蜕皮间期表达量最高,蜕皮期次之,在蜕皮前期表达量最低。组织表达分析发现,PmGLUT2在淋巴组织中表达量最高,鳃组织次之,在卵巢中表达量最低。96h急性盐度胁迫分析发现,PmGLUT2在肝胰腺与鳃中的表达量均受到抑制。斑节对虾Na+/K+/2Cl-协同转运蛋白(PmNKCC)cDNA全长3613bp,5’UTR48bp,3’UTR 382bp,包括30个碱基的poly(A)尾,开放阅读框(ORF)3183bp,可编码1060个氨基酸。预测其分子量为116.805kDa,理论等电点为6.29。序列含有11个糖基化位点,101个磷酸化位点,11个跨膜结构域。通过相似性、多重序列比对及进化树分析,PmNKCC与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)NKCC基因同源性最高,达93.68%。检测PmNKCC基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmNKCC的表达量随着幼体发育形态的变化呈周期性波动。蜕皮分析发现,鳃组织中PmNKCC在蜕皮后期表达量最高,蜕皮前期次之,在蜕皮期表达量最低。PmNKCC在斑节对虾各组织中都有表达,在鳃组织中表达量最高,淋巴次之,在肌肉中表达量最低。96h急性盐度胁迫分析发现,PmNKCC在肝胰腺、鳃、肠、胃组织中的表达量随胁迫时间的变化,呈先升高后下降的趋势。RNAi分析发现,在急性盐度胁迫实验中,注射dsPmNKCC能够降低PmNKCC的表达量,导致斑节对虾死亡率提高。根据获得的PmGLUT1、PmGLUT2与PmNKCC的cDNA全长,以基因组DNA为模板扩增三个基因的基因组序列。本文首次扩增得到三个基因的部分基因组序列,其中PmGLUT1序列长2148bp,在其中筛选得到了3个SNP位点;PmGLUT2序列长2837bp,在其中筛选得到了28个SNP位点;PmNKCC序列长4888bp,在其中筛选得到了66个SNP位点。在每个基因中挑选质量较好的位点进行了SNP位点分型与耐低盐性状关联分析。PmNKCC的PmNKCC 2061位点与PmNKCC2157位点在斑节对虾耐低盐能力最强与最弱极端群体中的基因频率有显著性差异(P<0.05),初步判断这两个位点与斑节对虾耐低盐性状存在一定关联性。本文研究结果表明PmGLUT1、PmGLUT2与PmNKCC三个基因在斑节对虾耐低盐代谢方面具有重要作用,响应了斑节对虾急性低盐胁迫应答反应,PmNKCC2061位点与PmNKCC2157位点可以作为耐低盐相关候选位点作进一步验证,以期应用于后续的斑节对虾耐低盐新品系选育工作中。