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Ⅱ型糖尿病是一种非胰岛素依赖的、以高血糖为特征的代谢性疾病,通常表现为餐后2小时血糖水平大于140 mg/d L或7.8 mmol/L。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是餐后碳水化合物消化的两种关键性糖苷酶,抑制其活性可有效延缓餐后碳水化合物的消化与吸收,降低餐后高血糖。另一方面,高血糖会加速机体内敏感性蛋白质(如血红蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白和晶状体蛋白等)发生非酶糖基化反应,引起蛋白质的结构和功能基团损伤,最终形成晚期糖基化终末产物(AGEs)导致糖尿病并发症的发生。茶是世界著名的三大饮料之一,享有“健康之液,灵魂之饮”的美名,在我国被誉为“国饮”。儿茶素是茶叶中的主要多酚类化合物,也是茶叶的主要功能性成份,具有抗氧化、降血糖、抗炎、降血脂和抗动脉粥样硬化等生理活性,但儿茶素对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和蛋白质非酶糖基化的抑制作用研究还比较少。因此,探讨儿茶素对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和蛋白质非酶糖基化的抑制作用及机制有助于诠释儿茶素独特的营养价值用于预防糖尿病及其并发症,将为儿茶素作为食品功能因子的研发提供理论基础,同时为膳食营养提供科学指导和实验依据,这对于促进儿茶素作为食源性抑制剂应用于食品工业、助力茶产业的发展有重要的意义。本论文以儿茶素中3种主要组分表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)为研究对象,分析了上述3种儿茶素对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的体外抑制作用、抑制动力学、结合性质及其对酶结构的影响,研究了儿茶素组分两两之间以及与阿卡波糖联合使用对酶活性的抑制效应。以牛血清白蛋白(BSA)–果糖、BSA–甲基乙二醛(MGO)为模型,研究了儿茶素对蛋白质非酶糖基化的抑制作用及抑制机制,并探讨了维生素C、苹果酸对EGCG抑制蛋白质非酶糖基化的影响,主要研究内容和结果如下:(1)ECG、EGCG和GCG对α-淀粉酶有较强的抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)分别为(45.30±0.22)、(137.15±0.13)和(30.02?±?0.23)μg/mL,抑制能力由大到小依次为GCG>ECG>EGCG,IC50均比阳性对照阿卡波糖(IC50=27.76±0.19μg/mL)大,3种儿茶素对α-淀粉酶的抑制类型均为混合抑制类型。当抑制α-葡萄糖苷酶时,ECG、EGCG和GCG的抑制类型分别为混合型、混合型和非竞争型,其IC50值分别为(4.03±0.01)、(1.05±0.02)和(1.15?±?0.32)μg/mL,抑制能力为EGCG≥GCG≥ECG,均显著强于阿卡波糖(IC50=79.41±0.19μg/mL)。两种儿茶素或它们与阿卡波糖联合使用对α-淀粉酶的抑制主要为拮抗作用,但两种儿茶素联用能协同抑制α-葡萄糖苷酶活性,而与阿卡波糖联用显示出相加效应。(2)ECG、EGCG与α-淀粉酶酶/α-葡萄糖苷酶作用时,只有一个结合位点,且氢键和疏水作用为主要作用力,GCG与α-葡萄糖苷酶的作用力与之相同,而范德华力和氢键驱动了GCG与α-淀粉酶的结合,这促使了ECG、EGCG和GCG与α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶结合形成基态复合物而猝灭酶的内源性荧光。25℃下,3种儿茶素与α-淀粉酶的结合常数(Ka)分别为(1.39±0.21)×105 L/mol、(5.49±0.21)×105 L/mol和(4.47±0.03)×104 L/mol,与α-葡萄糖苷酶结合的Ka分别为(3.46±0.20)×104 L/mol、(2.49±0.16)×105 L/mol和(7.31±0.05)×104 L/mol,EGCG与两种酶的亲和力均比ECG和GCG强。同步荧光和圆二色光谱显示ECG、EGCG和GCG引起了α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶中色氨酸与酪氨酸微环境及酶二级结构发生变化。分子模拟表明ECG、EGCG结合在α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶活性中心,占据了酶的活性位点,阻止了底物的结合,从而抑制了酶活性,而GCG结合在α-葡萄糖苷酶活性活性中心附近,引起酶构象发生改变,占据了底物进入活性中心的通道而阻碍了底物与酶的作用,使得酶的催化活性下降。(3)以BSA–果糖为模型,研究了ECG、EGCG和GCG对蛋白质非酶糖基化初、中、末期3个阶段产物(果糖胺、二羰基化合物和荧光AGEs)、蛋白质功能基团(羰基化、自由巯基)、蛋白质氧化产物(AOPP)、蛋白质交联结构以及蛋白质构象和疏水性的影响。结果表明,ECG、EGCG和GCG均能抑制阶段性产物形成,且抑制果糖胺和荧光AGEs的活性比二羰基化合物高;它们可降低蛋白质羰基含量,但阻止巯基含量降低的效果不够明显;ECG、EGCG和GCG均可抑制AOPP和淀粉样β-交联结构的形成,在一定程度上缓解了果糖引发的BSA二级结构的变化及蛋白质疏水性的降低。(4)研究了ECG、EGCG和GCG清除自由基、捕获MGO、螯合Fe2+、还原Fe3+以及结合BSA的能力,分析了它们对BSA–MGO体系产生AGEs的抑制作用及机制。结果表明,ECG、EGCG和GCG对O2.-均具有较强的清除活性(92.9%、50.2%和85.3%),且螯合Fe2+和还原Fe3+能力较强,这可能阻止了体系中的氧化过程;儿茶素能够有效地捕获AGEs前体物MGO,且ECG捕获MGO(摩尔浓度比为1:3和1:10)形成了ECG–MGO-单加合物和ECG–MGO-双加合物,GCG捕获MGO(摩尔浓度比为3:1和6:1)形成了两种GCG–MGO-单加合物;ECG、EGCG和GCG均能够结合BSA,结合常数(Ka)在104数量级,且ECG与BSA结合的Ka值较大;3种儿茶素对BSA–MGO体系中AGEs的抑制率为98.1%、97.3%和96.7%。儿茶素抑制蛋白质非酶糖基化、减少AGEs形成的机制可能与其对体系中氧化过程的阻止、捕获MGO以及结合BSA的活性相关。(5)研究了维生素C、苹果酸对EGCG捕获MGO、抑制蛋白质羰基化和AGEs形成、清除O2.-以及结合BSA的影响。结果表明,当维生素C/苹果酸浓度为1.7–35.2μg/mL时,维生素C可促进EGCG对MGO的捕获,而苹果酸仅仅能够明显促进8.9μg/mL EGCG对MGO的捕获。维生素C能够增强EGCG对蛋白质羰基化和AGEs的抑制,而苹果酸的增强作用不明显。17.6μg/mL维生素C/苹果酸最能促进浓度为8.9和35.4μg/mL EGCG对O2.-的清除。维生素C、苹果酸均能加强EGCG与BSA的结合作用,其Ka值分别由(6.86±0.19)×104 L/mol增加到(7.42±0.13)×104 L/mol和(7.76±0.18)×104 L/mol。与苹果酸相比,维生素C增强EGCG抑制蛋白质非酶糖基化活性可能源于它提高了EGCG捕获MGO、清除O2.-以及结合BSA的能力。