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背景和目的急性肺损伤的死亡率极高,严重危害人类的健康,寻找对急性肺损伤有疗效的药物,降低病死率,是目前国内外学者共同关心的课题。急性肺损伤是由严重感染、休克、创伤等因素引起的以炎症反应和肺泡毛细血管损伤为主要病理改变,临床表现为进行性的呼吸困难和顽固性低氧血症。内毒素是首要致病因素,而Toll样受体4(toll-like receptor4, TLR4)在机体抗感染的免疫炎症反应中扮演着重要角色,是内毒素信号向细胞内传导的“门户蛋白”,激活NF-κB,进而诱导IL-1、IL-6、IL-8、TNF-a等多种细胞因子和化学因子的生成与释放,引发以中性粒细胞浸润、微血管内皮细胞损伤与蛋白液体渗漏为特征的失控的炎症反应。而机体在引发SIR的同时,又伴发了代偿性抗炎反应(compensatory anti-inflammatory response, CAR),释放内源性抗炎介质如IL-10、IL-11、IL-13、TGF-β等。如果SIR和CAR处于动态平衡,自稳态则得以维持,利于ALI/ARDS’恢复。蜕皮甾酮(ecdysterone, EDS)是在动植物中提取的单体成分,目前所知其作用主要有：1)、促进核酸及蛋白质的合成;2)、调节糖代谢：3)、调节脂代谢：4)、调节基因表达;5)、改善免疫功能：6)、抗氧化作用;7)、促进缺血区血管的生成和侧支循环的建立;8)、促进多种细胞增殖的作用等。本课题组前期研究证明蜕皮街酮能有效减轻脂多糖引起的肺损伤,但机制尚不清楚,为此,本课题拟以组织细胞水平和分子水平对脂多糖致急性肺损伤的保护作用机制研究。旨在证实EDS的生物学抗炎作用机制,对炎症信号通路的干预作用,阐明EDS保护ALI的机理,为临床应用EDS治疗内毒性急性肺损伤提供更坚实的理论基础和实验数据。方法1.采用腹腔注射LPS的方法复制大鼠内毒性ALI模型,按随机原则将120只wister大鼠分为空白对照组(control组)、ALI模型组(LPS组)和蜕皮甾酮低剂量组(LPS+EDS20mg/kg组)、蜕皮甾酮中剂量组(LPS+EDS30mg/kg组)、蜕皮甾酮高剂量组(LPS+EDS40mg/kg组)。各组根据注射脂多糖后观察时间不同再分为2、4、24h共3个亚组,每组8只。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)待麻醉后,除control组外,其余各组大鼠均经腹腔注射8mg/kg的脂多糖复制急性肺损伤模型。建模后2h、4h和24h,采血和采取肺组织标本备用。2、对各组大鼠的Pa02、肺体指数、肺通透指数、BALF中性粒细胞计数进行观测,采用电子显微镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞的超微结构变化,实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测肺组织IL-10mRNA、TLR4mRNA和TLR4蛋白的表达,ABC-ELISA法测定血清TNF-α、IL-10含量的变化和以及肺组织SOD活性变化。结果1、与LPS组比较,LPS+EDS不同剂量治疗组在同一时间点均不同程度抑制肺体指数、肺通透指数(LPI)、BALF中性粒细胞计数的增加和Pa02的下降(P<0.05)。2、在注射脂多糖24h后,LPS+EDS高剂量组见肺泡Ⅱ型上皮细胞相对不规则,细胞变性,少数崩解,表面微绒毛减少,胞浆内线粒体肿胀,板层小体排空、空泡化程度较ALI模型组明显轻。3、LPS+EDS不同剂量治疗组在2h、4h、24h各时间点IL-10mRNA表达与LPS组比较均明显升高(P<0.05)。LPS+EDS各治疗组间在同一时间点IL-10mRNA的表达均有明显差异,其中于4h、24h时间点IL-10mRNA的表达呈递增趋势(低剂量组>中剂量组>高剂量组),2h时间点高剂量组IL-10mRNA的表达分别显著高于中、低剂量组(P<0.05)。4、Western免疫印迹法检测显示,与control组比较,LPS组在各时间点的TLR4蛋白表达均明显增高,差异有统计学意义(均P<0.05),其中4h表达最高。使用不同剂量EDS作用于建模后的大鼠,2、4、24h三个时间点分别与LPS组比较,各治疗组均可显著降低TLR4蛋白的表达(均P<0.05)。经SNK-q检验提示,各时间点LPS+EDS不同剂量治疗组组间差异,均有统计学意义,2h时间点TLR4蛋白的表达呈递减趋势(低剂量组>中剂量组>高剂量组),差异有统计学意义(均P<0.05),4h时间点中、高剂量组分别与低剂量组比较TLR4蛋白的表达显著性降低(P<0.05),24h时间点高剂量组与低剂量组比较有显著性差异(P<0.05),简言之,EDS在一定的剂量范围内可显著降低TLR4蛋白表达,并呈剂量正相关性5、LPS+EDS不同剂量治疗组在2、4、24h各时间点TLR4mRNA表达与LPS组分别比较均明显降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。LPS+EDS各治疗组在同一时间点组间TLR4mRNA的表达差异,均有统计学意义(均P<0.05),其中于4h时间点TLR4mRNA的、表达呈递减趋势(低剂量组>中剂量组>高剂量组),三组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)；2h时间点中、高剂量组分别与低剂量组比较TLR4mRNA的表达有显著性降低(P<0.05)；24h时间点高剂量组与低剂量组比较有明显差异(P<0.05)。6、ELISA结果显示,与LPS组比较,LPS+EDS各治疗组在不同时间点均可显著升高血清IL-10的含量(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+EDS各治疗组在不同时间点均可显著降低血清TNF-α的含量和显著增加肺组织SOD活性(均P<0.05)。结论1、蜕皮甾酮尾静脉注射对LPS诱导的ALI具有保护作用,改善肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤,上调肺组织IL-10mRNA,下调炎症通路中TLR4蛋白和mRNA的表达,从而抑制肺部局部炎症反应；其中EDS在一定的剂量范围内对TLR4蛋白和mRNA表达的影响,呈剂量正相关性2、减轻血清中TNF-a水平和增加IL-10水平等全身炎症因子和抗炎因子的表达,调节SIR和CAR的动态平衡,间接抑制肺部炎症反应的过度表达。