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绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)是一种革兰氏阴性的铜绿假单胞菌属产生的一种具有ADP核糖基化转移酶功能的毒素蛋白,它通过特异性的将哺乳动物细胞内的蛋白延长因子2进行不可逆的核糖基化作用而使之失活最终导致细胞死亡。对于这一毒素蛋白的细胞致死过程中复杂的细胞分子动力学过程也一直是人们探索的重点。 本研究通过构建四种荧光蛋白标记的绿脓杆菌外毒素A来对该毒素蛋白进入细胞的过程进行追踪,以确定细胞内蛋白毒素进入量与时间的关系,通过荧光共振能量转移的方式研究毒素蛋白在胞内经由酶切的效率与时间的关系,并对毒素蛋白转运以及酶切的位置进行了粗略的亚细胞定位。研究结果发现pH值的变化对PEA毒素分子进入到细胞内部速率并没有很显著的影响,而对毒素的毒性有增强作用的内质网特定信号序列KDEL则使毒素分子在内质网等特定细胞器聚集,这主要是因为天然毒素PEA的C段序列REDLK结合到了KDEL受体而最后被运送到内质网中。 在PEA毒素内化的过程中需要被细胞内的类furin蛋白酶将其从279～280的氨基酸之间切断才能够表现出后边催化结构域的活性,所以在探索这一酶切过程的酶切的效率和时间以及对酶切后的片段进行定位的需要,我们运用荧光共振能量转移(Fluorescent resonance energy transferring,FRET)的方法设计了一个具有两个荧光标签的PEA融合毒素蛋白,蓝色荧光蛋白(Enhanced blue fluorecsent protein,eBFP)和绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorecsent protein,eGFP)分别加到了精简的PEA毒素的N端和C端。结果发现在胞吞2h时,被furin酶切而具有催化活性的毒素分子只占被转运到HeLa细胞内部的全部PEA分子的5％左右。通过免疫细胞化学分析,发现有很多具有催化活性的毒素片段仍滞留在内质网,而且在这一过程中,细胞外环境中的低pH值对酶切的效率具有提高的作用。