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前言乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤,而淋巴结转移是乳腺癌重要的转移途径,也是影响患者预后的主要因素。目前为止,乳腺癌淋巴结转移的机制并不清楚。淋巴管是肿瘤细胞淋巴结转移的结构基础,近年来研究表明,血管内皮生长因子-C(VEGF-C)能够明显促进肿瘤组织淋巴管的生成,国外有研究表明肿瘤组织VEGF-C表达和肿瘤患者的淋巴结转移密切相关。最近在肺癌细胞系中研究显示:环氧化酶-2(COX-2)可以通过其产物前列腺素E2(PGE2)来上调VEGF-C的表达,可能参与淋巴结转移。COX-2是细胞内调节前列腺素合成的限速酶,只有在炎症或肿瘤等情况下,才会被丝裂原,细胞因子,生长因子或激素等诱导产生。COX-2在多种肿瘤中高表达,在乳腺癌中,国内外研究证实COX-2与乳腺癌的分期,淋巴结转移以及病人的预后密切相关,在乳腺癌的发生发展中起到重要的作用。因此,在乳腺癌中,研究COX-2和VEGF-C之间的关系对明确乳腺癌淋巴结转移发病机制具有重要意义。本研究旨在在组织和细胞两个水平,试图探讨COX-2和VEGF-C在乳腺癌的表达以及与患者临床病理特征及预后的关系。在乳腺癌组织芯片中,采用免疫组化SP法进行COX-2和VEGF-C表达的检测,分析它们之间的关系以及和患者预后的关系;在乳腺癌细胞系MCF-7中,转染pNLR-COX-2质粒,观察COX-2和VEGF-C蛋白的表达变化以及二者的关系,并用COX-2抑制剂塞来昔布作为处理因素,观察对转染后的MCF-7细胞中COX-2和VEGF-C表达的影响。材料与方法1、病例和样本组织芯片中的117例乳腺癌组织石蜡标本来自中国医科大学附属第一医院接受乳腺癌改良根治术或者保乳术的病人,术前均未经过放化疗并且有完整的随访资料,病人的平均年龄为51.4岁,病理类型为浸润性导管癌的为88例,其他类型的为29例;ⅠⅡ期患者为80例,Ⅲ期患者37例;发生淋巴结转移64例,随访日期从手术日期开始,到疾病复发或随访截止日期为止,随访截止日期为2008年2月1日,随访日期为4-70个月。2、试剂兔抗人COX-2抗体购自武汉博士德,羊抗人VEGF-C抗体购自R&D公司,二抗购自北京中衫金桥公司,转染试剂Fugene6购自Roche MolecularBiochemicals,塞来昔布购自Pharmacia公司,IPTG购自上海生工生物工程技术服务有限公司,pNLR-COX-2质粒由台湾大学Min-Liang Kuo教授馈赠,ECL试剂盒购自PIERCE公司。3、免疫组化乳腺癌芯片由上海芯超生物科技有限公司制作。采用免疫组化SP法检测COX-2和VEGF-C的表达,按照SP检测试剂盒说明书所示步骤进行。4、细胞培养及瞬时转染乳腺癌细胞MCF-7来自天津血液研究所,常规培养传代。在六孔板中,每孔种2.5×10~5个细胞,参照Fugene6的说明书进行瞬时转染pNLR-COX-2质粒。5、Western blot分别在瞬时转染pNLR-COX-2质粒后24小时及塞来昔布处理24小时收集细胞,经细胞裂解液裂解,蛋白抽提上样,以10%的SDS-PAGE胶分离后电转移至PVDF膜上,分别用COX-2和VEGF-C的一抗和相应二抗处理后,用ECL法进行显像。6、结果判定COX-2的免疫组化以胞浆中出现棕黄色颗粒为显色,以阳性细胞数≤10%为阴性,＞10%为阳性,VEGF-C的免疫组化需要对所有的肿瘤细胞进行评定:一,癌组织不显色为阴性;+,局部显色占所有癌组织面积＜5%;++,局部显色占所有癌组织面积5—20%;+++,广泛显色占所有癌组织面积＞20%。“++”和“+++”定义为VEGF-C高表达,“-,+”定义为VEGF-C低表达。7、统计分析方法用SPSS13.0进行统计学分析,进行x~2检验、Spearman秩相关检验,生存率采用Kaplan-Meier法计算,无病生存期差别的比较用Log-Rank时序检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果1、在乳腺癌组织中COX-2和VEGF-C的表达以及两者与患者临床病理特征的关系:117例乳腺癌组织中COX-2、VEGF-C均呈高表达,分别为55.8%、58.1%,且二者表达呈正相关(r=0.356,P=0.000)。COX-2表达与临床分期(r=0.201,P=0.029)、ER(r=0.224,P=0.015)、Her-2(r=0.254,P=0.006)、是否复发(r=0.312,P=0.001)及淋巴结转移(r=0.430,P=0.000)呈正相关。VEGF-C表达与临床分期(r=0.317,P=0.001)、淋巴结转移(r=0.202,P=0.029)、是否复发(r=0.205,P=0.027)呈正相关。2、COX-2和VEGF-C与乳腺癌患者预后的关系:COX-2阳性表达的患者无病生存期明显缩短(log-rank检验,P=0.004),VEGF-C高表达的患者无病生存期也明显缩短(log-rank检验,P=0.016),两者均高表达的患者和任何一个为高表达的患者,均比两者都低表达的患者的无病生存期缩短(log-rank检验,P值分别为0.002,0.022)。3、在乳腺癌细胞中,COX-2和VEGF-C的关系:0h,24h可以观察到转染p-NLR-COX-2质粒后,MCF-7细胞中COX-2蛋白的表达呈时间依赖性的上调,同时VEGF-C蛋白的表达也随之上调。4、在乳腺癌细胞中,塞来昔布对VEGF-C表达的影响:转染p-NLR-COX-2质粒24h后,再经终浓度为20微摩尔的塞来昔布的处理,MCF-7细胞中VEGF-C表达量下降,但COX-2的蛋白量没有下降。结论1、COX-2与VEGF-C在乳腺癌组织中高表达,两者呈正相关,均与淋巴结转移有关,是乳腺癌预后不良的指标。2、两者的联合检测对乳腺癌患者的预后判断更有临床意义,两者均高表达的患者的无病生存期明显缩短。3、在乳腺癌MCF-7细胞中,COX-2表达促进VEGF-C的表达上调。低剂量的塞来昔布抑制VEGF-C的表达,但可能不是通过影响COX-2蛋白的量发挥作用。