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脂质立方液晶（Cubs）是一种新型药物载体,因其双连续通道结构使得其在难溶性大分子药物的包载与体内运输过程中有巨大优势,杜仲由于其资源稀少,又因其滋补的功效甚佳,所以自古就被视为名贵中药材,《神农本草经》记载,杜仲可补中益气,强筋骨,而植物多糖有着抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫活性的功能,尤其是在机体免疫层面,免疫细胞存在多种多糖受体,植物多糖可提高免疫细胞的活性,使其能在免疫反应过程中发挥更好的作用。目前尚未有关于杜仲叶多糖（PsEUL）配合Cubs在机体免疫活性探究的相关研究报道,为探究将PsEUL与卵清蛋白（OVA）偶联并通过Cubs作为疫苗佐剂对小鼠的免疫活性,本试验使用超声热水提取PsEUL并使用碳二胺盐酸盐（EDC）缩合法将PsEUL和OVA通过化学键偶联在一起,并使用植烷三醇作为两亲性脂质物质制备PsEUL-OVA/Cubs,并分别对PsEUL-OVA和PsEUL-OVA/Cubs进行体内外试验,探究其免疫活性以期为植物多糖修饰抗原和新型疫苗佐剂的开发提供一定的理论依据与数据支持。本次试验的主要方法与试验结果和结论如下:1.PsEUL的提取与优化。本试验采用超声热水提取PsEUL,使用傅里叶红外光谱对提取的PsEUL进行鉴定,并通过大孔树脂对提取的PsEUL进行脱色工艺优化,使用硫酸苯酚法测定PsEUL多糖含量。结果显示,PsEUL在红外光谱下具有典型的多糖吸收峰,并且PsEUL是含有吡喃糖和呋喃环的酸性多糖;通过硫酸苯酚法对超声水提的PsEUL的提取率进行计算,PsEUL的提取率为5.7%;通过两种方式对PsEUL进行脱色处理,当采用大孔树脂为脱色的材料,使用乙醇作为洗脱液时,乙醇浓度为5%时,脱色率和多糖保有率最佳。2.杜仲多糖与OVA偶联物（PsEUL-OVA）的制备与表征。将PsEUL在EDC中与OVA反应得到杜仲叶多糖与OVA的偶联产物PsEUL-OVA,在葡聚糖凝胶G-150的层析柱上通过记录洗脱液的紫外吸收值,得到纯化的PsEUL-OVA。并使用傅里叶红外光谱、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、扫描电子显微镜以及BCA试剂盒进行表征。将PsEUL和PsEUL-OVA分别进行红外光谱扫描,结果显示,PsEUL-OVA的红外光谱在1580 cm-1处出现了己二酰肼上对应的C=O伸缩振动峰,表明PsEUL已经成功通过共价键-CO-NH-的形成偶联到OVA上;通过SDS-PAGE检测OVA和PsEUL-OVA,与OVA相比,PsEUL-OVA的条带明显上移至压缩胶部分,表明分子量增大,表明PsEUL成功与OVA偶联;通过SEM观察发现PsEUL和PsEUL-OVA的形貌发生了明显变化,PsEUL-OVA的颗粒发生黏连,说明OVA与PsEUL成功的结合在一起;通过使用BCA法和硫酸苯酚法计算得到PsEUL-OVA的转化率（%）=46.25%±4.2%;多糖与蛋白的比为48.1%±6.8%。3.PsEUL-OVA体内外免疫活性的探究。为了探究PsEUL-OVA的免疫活性,本试验通过CCK-8法研究了PsEUL-OVA体外脾细胞和巨噬细胞活性,并测定PsEUL-OVA对脾细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌水平的影响,再以FITC标记OVA,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对FITC标记的PsEUL-OVA的吞噬效果;体内试验,90只ICR小鼠随机分为6组,空白组、PsEUL组、OVA组、PsEUL与OVA混合组、PsEUL-OVA组,弗氏佐剂（FCA）阳性对照组。各组小鼠给药后在不同时间点检测各种免疫指标的变化,通过流式细胞仪分别检测了小鼠脾脏细胞中CD4+、CD8+的表达,以及树突状细胞表面成熟标志因子CD80、CD86以及MHC-II的表达水平;同时检测了PsEUL-OVA对小鼠免疫器官指数、血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6浓度以及OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b的水平的影响。体外试验结果显示,PsEUL-OVA的浓度为200μg/m L时小鼠脾细胞活性与巨噬细胞活性显著高于其余各组（P<0.05）;PsEUL-OVA能够分别提高淋巴细胞与巨噬细胞的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4、IL-6的分泌水平;激光共聚显微镜发现巨噬细胞对PsEUL-OVA的吞噬效果显著高于其他各组。体内试验表明,PsEUL-OVA可以显著提高小鼠免疫器官指数;小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b的水平及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平,提高脾淋巴细胞中CD4+T与CD8+T的分化,促进小鼠树突状细胞表面成熟标志因子CD80、CD86、MHC-II表达水平。4.PsEUL-OVA/Cubs的制备与表征。使用植烷三醇作为双亲性脂质物质加入F127水溶液,使用超声均质法制备PsEUL-OVA/Cubs,通过透射电镜观察、偏光显微镜观察、Zeta电位和粒径分析,并测定PsEUL-OVA/Cubs包封率与载药量对PsEUL-OVA/Cubs进行表征。结果显示,通过TEM对PsEUL-OVA/Cubs进行观察,可见制备的PsEUL-OVA/Cubs呈现出六面体与立方体结构,且分布比较均匀,大小也相对均一;在偏光显微镜下观察,常温下PsEUL-OVA/Cubs为暗视野,无偏光,将PsEUL-OVA/Cubs加热至60℃可以观察到视野逐渐变亮,结构也变明显。由此可以证实PsEUL-OVA/Cubs为立方相结构,光学特点为各向同性;通过测定PsEUL-OVA/Cubs的粒径和Zeta电位,PsEUL-OVA/Cubs平均粒径（AD）为（381.68±12.28）nm,多分散系数（PDI）为（0.175±0.01）,平均Zeta电位为（-10.43±0.3）m V,说明PsEUL-OVA/Cubs分散性良好,比较稳定;通过包封率和载药量的计算公式算出制备的PsEUL-OVA/Cubs包封率为78.12%±1.23%,载药量为80.75%±2.43%。5.PsEUL-OVA/Cubs体外免疫活性研究。本试验通过CCK-8法探究PsEUL-OVA/Cubs对体外培养的脾细胞和巨噬细胞活性的影响,并测定了PsEUL-OVA/Cubs对脾细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌水平的影响,再以FITC标记OVA,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对FITC标记的PsEUL-OVA/Cubs的吞噬效果,最后将PsEUL-OVA/Cubs与巨噬细胞共培养,并通过高通量测序分析PsEUL-OVA/Cubs对小鼠巨噬细胞的基因表达的影响。结果显示,PsEUL-OVA/Cubs的浓度为150μg/m L时小鼠脾细胞活性与巨噬细胞活性显著高于其余各组（P<0.05）;PsEUL-OVA/Cubs能够显著提高脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,促进巨噬细胞分泌IL-4、IL-6;激光共聚显微镜观察发现巨噬细胞对PsEUL-OVA/Cubs的吞噬效果显著高于其他各组;高通量测序发现,PsEUL-OVA/Cubs处理小鼠巨噬细胞24h后,RAW264.7基因表达谱中出现差异表达相关基因3385个,其中显著上调1891个,其中差异表达相关基因免疫相关富集通路为肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、抗原处理和递呈信号通路、吞噬体等信号通路。6.PsEUL-OVA/Cubs体内免疫活性的探究。150只ICR小鼠分为10组,空白组、PsEUL组、OVA组、PsEUL与OVA混合组、PsEUL-OVA组、PsEUL/Cubs组、OVA/Cubs、PsEUL+OVA/Cubs组、PsEUL-OVA/Cubs组,弗氏佐剂（FCA）阳性对照组。通过流式细胞仪分别检测了小鼠脾脏细胞中CD4+、CD8+的表达和树突状细胞表面成熟标志因子（CD80、CD86和MHC-II）的表型变化;此外检测了PsEUL-OVA/Cubs对小鼠免疫器官指数、血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的浓度以及OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平的影响。结果显示,PsEUL-OVA/Cubs可显著提高小鼠免疫器官指数,显著上调小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类抗体水平,同时显著提高小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平;PsEUL-OVA/Cubs能够显著促进脾淋巴细胞中CD4+T与CD8+T的分化,显著提升小鼠树突状细胞CD80+、CD86+、MHC-II的表达水平。综上所述,PsEUL与OVA偶联可以显著提高PsEUL的免疫增强活性。PsEUL-OVA/Cubs在体外可显著增强巨噬细胞的吞噬能力,提高细胞因子的分泌水平。在体内PsEUL-OVA/Cubs可以显著提高小鼠血清OVA特异性IgG及其亚类的抗体水平,增强血清细胞因子水平以及增强T、B淋巴细胞的增殖能力,提高CD4+、CD8+的表达,促进树突细胞的成熟。根据高通量测序结果推测PsEUL-OVA/Cubs对机体免疫活性的影响是通过影响差异基因富集,从而表达与免疫相关蛋白来实现的。