论文部分内容阅读
钠尿肽(natriureticpeptide，NP)是一类结构相似的肽类物质的总称，包括心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、脑型钠尿肽(brainnatriureticpeptide，BNP)和C型钠尿肽(C-typenatfiumficpeptide，CNP)。它们起源于不同的基因，但都拥有一个结构类似的17个氨基酸内环。钠尿肽及其相应的钠尿肽受体(natriureticpeptidereceptor,NPR；NPR-A，NPR-B，NPR-C)分布于整个中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)，提示NPs及其受体在CNS中可能起到了非常重要的神经调质作用。近年来的研究表明，NPRs参与调控情绪变化、应激激素的释放、摄食、觉醒及自主神经的节律。然而，NPs参与神经信号传递调控却所知甚少。双极细胞(bipolarcell，BC)在视网膜中是第二级神经元，在视网膜中它可以将光感受器获得的视觉信号传递给无长突细胞(amacrinecell，AC)和神经节细胞(ganglioncell，GC)。通过激活BCs上不同的谷氨酸受体，两种类型的双极细胞(ON型BC和OFF型BC)可以产生ON型和OFF型信号通路。在哺乳动物视网膜中，双极细胞也可以分为视杆双极细胞(rodbipolarcell，RBC)和视锥双极细胞(conebipolarcell，CBC)，并且大量研究表明所有的RBC都是ON型的，而CBC既有ON型的也有OFF型的。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)受体的两个亚型GABA^和GABAc主要存在于BC的树突和轴突上。在本工作中，我们应用免疫组织化学方法、全细胞膜片钳记录结合快速溶液切换装置(RSC-100)、钙成像技术，首次系统地报道，BNP通过与NPR-A受体结合增加胞内钙浓度(intracellularcalciumconcentration，[Ca2+]i)，从而抑制大鼠双极细胞上GABA受体介导的电流。这项研究不仅揭示了NPs作为神经调质在视网膜的重要作用，也为我们进一步了解NPs在CNS中的作用提供了非常重要的启示。
通过免疫组织化学的方法，我们观察到两种钠尿肽受体NPR-A和NPR-B广泛地表达在大鼠视网膜外网状层(outerplexiformlayer,OPL)和内网状层(innerplexiformlayer,IPL)，并且证实两种受体在BC上均有较强的表达。NPR-A和NPR-B两种受体在BC上的亚细胞分布是非常类似的。无论是PKC阳性表达的ON型RBC还是PKC阴性表达的OFF型BC，NPR-A和NPR-B几乎表达在它们所有亚细胞部位，包括树突、胞体、轴突和轴突终末。利用全细胞膜片钳技术，将BC的细胞膜电位钳制在-60mV时，在约一半分离大鼠的BCs上，NPs可以诱导出一种内向电流。由ANP和BNP引导的内向电流可以被NPR-A的特异性抑制剂anantin完全阻断，提示ANP和BNP是通过NPR-A介导的内向电流。进一步研究表明，NPs所诱导的电流翻转电位在．8mV，可以完全被胞外Cd2+和胞外无阳离子(cation-free)溶液所阻断，并且可被胞外无钙(Ca2+-free)溶液所增强，这些结果均提示该电流是cGMP诱导的非选择性阳离子电流(cGMP-gatednonselectedcationchannel，CGC)。为了进一步验证CGC的确表达在分离的BCs上，我们在胞内给予了cGMP来引导CGC电流。当电极内液中给予4mMcGMP，我们同样引导出了一个性质类似的内向电流。另外，当胞外给予磷酸二脂酶(phosphodiesterase，PDE)的抑制剂lmmIBMX，在BCs上同样可以诱导出一个显著的内向电流。
我们进一步分析了大鼠视网膜双极细胞上GABA受体所介导电流的特性。50μM的GABAA受体激动剂muscimol可以诱导一个失活较快的瞬间的内向电流，通过公式拟合可以计算出它的失敏时间常数(τ)是1.24s。200μMGABAc受体激动剂cis-4-aminocrotonicacid(CACA)可以诱导出一个持续的几乎无失敏的内向电流。GABAB受体激动剂baclofen在BCs上诱导不出任何可见电流。GABAA受体介导电流的翻转电位是1．2士2．4mV，而GABAc受体所介导电流的翻转电位是-1．4±3.2mV。通过分析引导GABAA电流和GABAc电流对GABA的量效关系，可以得到GABAA受体介导电流的半反应浓度(concentrationofhalf-maximalresponse，ECso)是51，3士6．2gM，而GABAc受体介导电流的ECso是6．0±O．6μM。这个结果提示，GABA对GABAc受体的亲和力大约是GABAA受体亲和力的8倍。
进一步研究表明，BNP可以显著抑制GA．BAA电流而对GABAC电流无影响。BNP的抑制作用可以被anatin阻断，而NPR-C受体特异性激动剂c-ANF不能模拟BNP的作用，这表明BNP的抑制作用是通过NPR-A起作用的，NPR-C受体不参与这一作用。与BNP类似，胞外给予8Br-cGMP同样可以抑制GABAA电流而对GABAc电流无影响。胞外给予pGC-A／B的特异性抑制剂HS-142-1可以显著地抑制BNP的作用。这些结果提示，BNP抑制GABA电流的作用是通过与NPR-A结合后提高胞内cGMP的水平而实现的。当电极内液中给予cGMP依赖蛋白激酶G(cGMP-dependentproteinkinaseGPKG)的特异性抑制剂KT5823可以显著地削弱BNP抑制GABA的作用。另外，钙成像实验表明BNP可以显著地增加BCs的[Ca2+]i。当胞外持续给予Ca2+-free溶液(含lOmMEGTA)，GABA电流没有显著的变化。在胞外无钙条件下，BNP仍可抑制GABA电流。然而，当细胞内处于Ca2+-free的条件下(含10mMBAPTA)，可以显著地增加GABA电流。并且在胞内Ca2+-free条件下，BNP抑制GABA电流的作用几乎消失。这些结果表明，在我们的实验条件下BNP抑制GABA电流的作用是通过增加[Ca2+]i来实现的，而胞外钙离子并不参与这一作用。当胞内给予IP3受体的抑制剂heparin和xestospongins-C阻断胞内IP3受体介导的钙库释放，BNP仍可以显著地抑制GABA电流。然而，应用ryanodine受体的调节剂咖啡因、ryanodine、钌红来阻断ryanodine受体介导的钙库释放途径，可以明显地抑制GABA电流，并且在此条件下BNP抑制GABA电流的作用几乎完全消失。进一步研究表明，BNP抑制GABA电流的作用可以显著地被钙调蛋白(calmodulin，CaM)抑制剂W-7和calmidazolium所阻断。因此本实验结论是，BNP与NPR-A受体结合后通过激活cGMP／PKG途径诱导ryanodine受体介导的钙释放再激活CaM途径对BC上的GABA电流产生抑制作用。